Détection des lipides sur les plaques de CCM

Les solutions de coloration utilisées sont pour la plupart trés corrosives et dangereuses. Travailler avec des gants, sous la hotte et en prenant le maximum de précautions.

Méthodes générales pour les lipides :

Vapeur d'iode

C'est une méthode de coloration réversible et non destructrice qui est très employée. Après chromatographie, la plaque est séchée sous la hotte et introduite dans une cuve hermétiquement fermée qui contient quelques cristaux d'iode. L'iode en se sublimant réagit avec les acides gras insaturés. les lipides sont colorés en jaune-brun. La coloration se fait en quelques minutes ou en quelques heures en fonction de la quantité de lipide. Les spots sont délimités à l'aide d'un crayon. La plaque est laissée à température ambiante pour éliminer l'iode.
En cas de comptage des lipides radioactifs par scintillation liquide, il faut éliminer complètement l'iode car c'est un agent de quenching.

Acide sulfurique chaud

Réactions spécifiques des phospholipides

Coloration générale des phospholipides

C'est une méthode de coloration du phosphate

Préparation du réactif :

• (solution a) Dissoudre 16 g de molybdate d'ammonium dans 120 mL d'eau
• (solution b) Ajouter 10 mL de mercure à 40 mL d'HCl concentré. Mélanger avec 80 mL de la solution a. Agiter le mélange pendant 30 min et filtrer.
• (solution c) Ajouter la solution b à 200 mL de H₂SO₄concentré puis ajouter le restant de la solution a. Ajuster à 1 L avec de l'eau distillée. Conserver dans un flacon brun.

Coloration :

Après avoir évaporé les solvants d'élution, pulvériser la solution c sur la plaque. Attention le mélange est corrosif et dangereux. Travailler sous la hotte avec des gants et une protection. Après quelques minutes, les phospholipides sont colorés en bleu.La couleur n'interfère pas avec les colorations des phospholipides qui peuvent être faites ultérieurement.

Coloration des groupes aminés

La phosphatidylethanolamine,phosphatidylserine et d'autres lipides avec des groups aminés libres sont colorés à la ninhydrine.

Coloration :

La plaque est pulvérisée avec une solution acétonique de ninhydrine (0.25% dans l'acétone). La coloration se développe après un chauffage à l'étuve autour de 100-110°C. Les spots sont colorés en rose violacé. Travailler sous la hotte et utiliser des gants.

Coloration des lipides contenant la choline (phsphatidylcholine et sphingomyéline)

C'est le réactif de Draggendorff

Préparation du réactif

• (solution a) Dissoudre 1.7 g de nitrate de bismuth dans 100 mL d'acide acétique à 20%.
• (solution b) Dissoudre 10 g de iodure de potassium dans 25 mL d'eau.
• (solution c) Mélanger 20 mL de la solution a à 5 mL de la solution b et ajouter 70 mL d'eau.
  
  

Coloration

Pulvériser la solution c sur la plaque. Après quelques minutes les lipides contenant la choline sont colorés en orangé.

Coloration des glycolipides

L'a-naphtol les glycolipides, cérébrosides, sulfatides, glycosyldiglycérides et les gangliosides.

Préparation du réactif :

• (solution a) Dissoudre 0.5 g d' a-naphtol dans 100 mL de méthanol : eau (1 :1 v/v)
• (solution b) Ajouter 5 mL d'eau distillée à 95 mL d'acide sulfurique concentré.

Coloration

Après séchage de la plaque, pulvériser la solution a. Sècher la plaque puis pulvériserr la solution b. Attention le réactif b est très corrosif. Travailler sous la hotte avec des gants et une protection.
Chauffer la plaque à 120°C jusqu'à ce que la coloration se développe. Les glycolipides sont colrés en bleu-pourpre. Les autres lipides polaires sont colorés en jaune.

Coloration des gangliosides

Les gangliosides sont colorés par un réactif à base de résorcinol.

Préparation du réactif :

• Dissoudre 2 g de résorcinol dans 100 mL d'eau distillée. Au moins 4 heures avant la coloration, mélanger 10 mL de cette solution à 80 mL d'HCl concentré contenant 0.5 mL de sulfate de cuivre 0.1 M ( 2.5g de CuSO₄. 5 H₂O dans 100 mL d'eau). Ajuster le volume à 100 mL avec de l'eau distillée.
  

Coloration

Pulvériser la plaque avec le réactif. Recouvrir la plaque avec une autre plaque de même dimension et chauffer l'ensemble à 120°C. Les gangliosides sont colorés en bleu-violet.

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