Introduction

Cette composition globale simple reflète en fait une très grande complexité. La classe des lipides, par exemple, est extrêmement variée et les propriétés physico-chimiques de la membrane, sa fluidité, son adaptabilité aux changements environnementaux reposent en grande partie sur cette diversité moléculaire. Chez E.Coli par exemple, on trouve jusqu'à 100 entités chimiques différentes de phospholipides. La diversité chimique provient essentiellement de la nature différente des groupes acyl qui estérifient le glycérol. Chez un organisme eucaryote, le nombre de phospholipides différents pourraient être 10 fois plus important que chez un procaryote.

Une caractéristique générale des membranes est leur nature amphiphatique (amphiphile): une couche centrale hydrophobe (non polaire) est prise en sandwich entre deux couches hydrophiles (polaires).

Inventaire des constituants

Lipides

Composition générale

La structure de base de la membrane est une bicouche de lipides amphiphiles. Il apparaît quelque fois des zones de rupture de la bicouche (organisation hexagonale ou même micelles) mais ces zones sont de faible importance.

La quantité de lipides s'exprime par comparaison avec la quantité de protéines. Le rapport "masse de protéines / masse de lipides" est souvent supérieur à 1. Il sera d'autant plus élevé que la membrane a une importante activité enzymatique.

Les lipides sont classés en 4 classes : (1)acides gras libres, (2) esters d'acides gras, triacylglycérol et phospholipides, (3)composés isoprénoïdes cycliques (stérols, esters des stérols) ou linéaires (ubiquinones, menaquinones, dolichol et farnésol), (4) glycolipides.

Les phospholipides sont les constituants majoritaires de toutes les membranes. Ils représentent souvent plus de 50% de la masse lipidique. Les stérols et les glycolipides sont en général concentrés dans la membrane plasmique des cellules animales. Les glycolipides sont particulièrement abondants dans les membranes des chloroplastes.

Phospholipides

Parmi les phospholipides, on trouve 2 classes de constituants : les glycérophospholipides et les sphingolipides.

Les glycérophospholipides (dérivés du diacylglycerol-3-phosphate) sont, de loin, les plus abondants.
Les plus importants des glycérophospholipides sont : la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS), le phsphatidylinositol (PI), le phosphatidylglycérol (PG), diphosphatidylglycérol (DPG).

Les acides gras qui estérifient le glycérol dans les phospholipides peuvent être extrêmement variés mais ils ont des propriétés largement partagées :

• ils sont non branchés chez les eucaryotes, branchés chez certains procaryotes (les archaebactéries)
• ils ont des chaînes longues (14 à 24 chez les animaux et 16 à 18 chez les plantes), à nombre de carbone pair.
• les acides gras insaturés ou polyinsaturés sont cis.
• les acides gras insaturés sont généralement en position sn-2.
• le résidu acyl en position sn-1 est, la plupart du temps, saturé.
  

Dans la membrane plasmique de foie de rat ou dans la membrane d'érythrocytes humains (valeur entre parenthèses), on trouve des résidus acyl allant de 16 à 24 atomes de carbone.

Composés isoprénoïdes

Les stérols

Les composés isoprénoïdes linéaires

Certains lipides polyisoprénoïdes comme les ubiquinones et les ménaquinones sont présents dans les membranes qui assurent un transfert d'électrons. Ce sont, en général, des molécules longues : le coenzyme Q₁₀ a, par exemple, 10 unités isoprènoïde avec 5 atomes de carbone chacune, ce qui lui donne une dimension supérieure à l'épaisseur de la bicouche. L'association de ces composés aux bicouches est mal connue.

Les protéines

Les protéines membranaires sont classées en 2 catégories sur la base de la technique utilisée pour les solubiliser (les extraire de la membrane).
On distingue :

Cependant, le fait que certaines protéines soient accrochées à la membrane grâce à la médiation d'un lipide isoprénoïde (farnésyl ou géranyl-géranyl) rend la distinction entre intrinsèque et extrinsèque moins évidente. En effet, la protéine elle-même est bien périphérique mais comme elle est liée covalemment au lipide d'ancrage (protéolipide), elle ne peut pas être détachée en jouant sur le pH ou la force ionique.

Les protéines périphériques

Ce sont des protéines globulaires qui sont associées à d'autres protéines membranaires ou à la partie polaire des phospholipides membranaires par leur propre partie polaire.
Leur rôle est structural ou fonctionnel. Elles peuvent par exemple servir d'intermédiare entre 2 protéines intégrales ou entre une protéine intégrale et le cytosquelette.

Le cytochrome c est un bon exemple de protéine périphérique. C'est le seul transporteur d'électrons de la chaîne respiratoire mitochondriale qui ne soit pas intégré à la bicouche. Il sert de navette entre le complexe III et la cytochrome oxidase.

Les protéines intrinsèques

Les protéolipides (protéines ancrées dans la membrane par l'intermédiare d'un lipide)

Ces protéines sont extérieures à la bicouche mais ancrées dans la partie lipidique par l'intermédiare d'un lipide comme le farnésol, les acides myristique ou palmitique ou encore, dans des cas assez fréquents, par une liaison avec un glycophosphatidylinositol (GPI). En fait, les 2 types d'ancrage lipidique se distinguent en fonction de la localisation de la protéine. La fixation au GPI se trouve essentiellement sur la face externe de la membrane plasmique. L'autre groupe de protéines, associées à des lipides à longue chaîne est localisé sur la face interne de la membrane plasmique.

Les sucres (glycoconjugués)

Ce sont des courtes chaînes glucidiques, souvent branchées, qui sont liées covalemment à des protéines ou à des lipides. Chez les eucaryotes, les chaînes oligosaccharidiques sont uniquement présentes sur la face externe de la membrane plasmique.

Les glycolipides

Ce sont des molécules amphiphatiques qui dérivent soit du diacylglycérol, soit de la N-acylsphingosine. Les dérivés du diacylglycérol sont abondants dans les membranes de plantes (mono et digalactosyl diacylglycérols) et de bactéries mais très rares dans les membranes animales.

Les glycoprotéines

Les protéoglycannes

.

Les forces qui assurent la cohésion des membranes

Les forces entre charges ponctuelles ou forces ioniques

Elles s'appliquent aux ions en solution. Elles sont, dans les membranes, à l'origine de l'augmentation de cohésion des phospholipides par les cations divalents. Ceux-ci sont associés aux têtes polaires chargées négativement des phospholipides acides.

Les forces entre charge et dipôle

Un dpiôle est un système constitué par 2 charges (q) opposées séparées par une distance d. Le moment dipolaire est q x d ; il s'exprime en Coulombs. mètre. L'unité courante est le Debye (1/3 10 ^-29 C.m). Les forces qui ont pour origine un dipôle sont directionnelles. Elles jouent un rôle primordial dans les phénomènes d'hydratation des ions en solution.

Les forces entre dipôles

Dans de nombreuses molécules, la répartition des charges est dissymétrique, ce qui confère à la molécule, électriquement neutre, un dipôle permanent. c'est la cas de l'eau, par exemple.
Sur d'autres molécules, le nuage électronique est symétrique, ces molécules sont neutres et apolaires. Cependant, le champ créé dans leur voisinage par une charge ou un dipôle permanent, provoque une modification de leur répartition électronique qui se traduit par la formation d'un dipôle induit. Ils se créent ainsi des forces appelées forces de Debye.
A priori, en absence d'un champ perturbateur, les molécules apolaires ne devraient pas agir entre elles. En fait, la mobilité du nuage électronique entraîne la formation de dipôles (dits instantanés) qui suffisent à créer des interactions électrostatiques ; ce sont les forces de London. Ces forces sont actives sur des distances très courtes. Ce sont elles qui assurent la cohésion entre les chaînes paraffiniques des phospholipides entre elles ou avec les cycles saturés du cholestérol.

La liaison hydrogène

Les interactions hydrophobes

Protocoles expérimentaux d'analyse des constituants membranaires

Lipides

Problèmes expérimentaux

Extraction des lipides

Les lipides sont des composés insolubles dans l'eau et solubles dans les solvants organiques. Les lipides membranaires couvrent une large gamme de polarité. Le cholestérol est hydrophobe, les phospholipides sont davantage polaires et les glycolipides ont une partie constituée de résidus glucidiques très hydrophiles.

Les lipides lorsqu'ils sont insaturés (mono mais surtout polyinsaturés) sont facilement oxydables. Les réactions d'auto-oxydation sont des réactions en chaîne qui peuvent être empêchées par la présence d'agents antioxydants tels que l' hydroxytoluène butylé (BHT) ou l' hydroxyanisole butylé (BHA). L'ajout d'un antioxydant est nécessaire pour le stockage des lipides après isolement.

Les membranes peuvent contenir des phospholipases qui hydrolysent les liaisons esters des phospholipides. Les phospholipases sont souvent activées par les ions calcium. La présence d'un agent chelatant (EDTAou EGTA) dans la fraction membranaire permet de limiter l'action des phospholipases.

Méthodes d'extraction

Les méthodes d'extraction sont basées sur l'utilisation de solvants organiques purs ou en mélange. Toutes les techniques commencent par un traitement des membranes par un solvant ou un mélange de solvant(s) organique(s) qui dénature(nt), précipite(nt) les protéines et solubilise(nt) les lipides.

Les méthodes classiques sont connues sous le nom de "Méthode de Folch et al." et "Méthode de Bligh & Dyer". Ces méthodes impliquent l'addition d'un mélange de solvants organiques et d'eau (chloroforme/méthanol/eau) à l'échantillon, de sorte qu'une phase homogène (une seule phase) soit obtenue. On ajoute ensuite une solution aqueuse saline pour obtenir 2 phases (une phase inférieure organique et une phase supérieure aqueuse). Les phases sont ensuite séparées par centrifigation ou par décantation.

Dans le cas des membranes contenant des gangliosides, on les retrouve dans la phase supérieure aqueuse.
Les composés lipidiques (autres que les gangliosides) sont dans la phase organique inférieure.

Séparation et purification des lipides

Les différentes classes de lipides peuvent être séparées par chromatographie préparative sur colonne d'acide silicique ou d'alumine.
La chromatographie sur couche mince (CCM) de gel de silice permet de séparer les lipides lorsqu'ils sont en faible quantité.
Les éluants utilisés pour la chromatographie dépendent de la polarité de la classe de lipides.

Chromatographie sur couche mince

La révélation des lipides sur les plaques fait appel à des techniques de coloration générales ou spécifiques.

La chromatographie bidimensionnelle des phospholipides sur couche mince donne d'excellents résultats de séparation.

L'élution de la plaque se fait d'abord dans le sens 1 est par le mélange de solvants : chloroforme :méthanol : ammoniaque 7M( 65 : 30 : 4, v/v). La plaque est ensuite séchée. Une seconde élution se fait dans une direction perpendiculaire à la précédente (sens 2) avec le système chloroforme : méthanol : acide acétique glacial : eau (170 : 25 : 24 : 4, v/v). Détection par pulvérisation d'acide sulfurique 50% et chauffage à l'étuve à 200°C.

Chromatographie liquide à haute pression (HPLC) pour séparer les phospholipides

Dans le procédé en phase normale, les phospholipides sont séparés en fonction de leur polarité.
Dans le procédé en phase reverse (la colonne est alors la phase non polaire), les phospholipides sont séparés en fonction de la longueur de chaîne et du degré d'insaturation.

Chromatographie en phase gazeuse pour identifier les résidus acyl

Les fonctions ester sont hydrolysées et les acides gras sont méthylés avant le passage sur colonne. Les acides gras méthylés sont plus volatiles.

Spectrométrie de masse couplée à la CPG ou à HPLC

Dosage des lipides

• Dosage des phospholipides
• Dosage du cholestérol et des esters du cholestérol
• Dosage des acides gras (FAME) par chromatographie en phase gazeuse

Protéines

Problèmes expérimentaux

Si l'isolement des protéines extrinsèques (périphériques) ne pose à priori pas de problèmes techniques majeurs, puisque ces protéines sont libérées par modification du pH du milieu ou de sa force ionique, la question de leur décrochage inopiné au cours des procédés de purification des membranes (avant analyse) est néanmoins posée.

La purification et la caractérisation des protéines intrinsèques nécessite la destruction de la structure native de la membrane et le problème majeur est alors de s'assurer que la fonction de la protéine et ses propriétés ne sont pas définitivement altérées au cours du processus de solubilisation.

La définition du critère de solubilisation est également un point à considerer. On se base sur la vitesse de sédimentation : 10 ⁶ g.min , 10 ⁷ g.min ?
Un critère souvent utilisé est le fait qu'une protéine soit dans le surnageant après une centrifugation à 105 000g pendant 1 heure.

Méthodes générales de solubilisation des protéines

Modification du pH

Les protéines extrinsèques peuvent être décrochées par des traitements à des pH éloignés du pH physiologique : par exemple pH 3 à 5 ou pH 8 à 12.

Modification de la force ionique

La force ionique du milieu peut être augmentée (concentrations salines de 0.15 M à 0.5 M) ou diminuée (0.1 à 1 mM EDTA) pour libérer des protéines faiblement liées par interactions électrostatiques à la membrane.

Addition d'agents chélatants (EDTA, EGTA)

La présence de chelatants des ions calcium ou magnésium permet de décrocher certaines protéines extrinsèques : en principe, il s'agit de protéines riches en résidus aspartyl ou glutamyl. EDTA ou EGTA sont souvent présents dans les divers milieux d'extraction.

Agents chaotropiques

Ce sont des composés organiques comme l'urée (6 M) ou la Guanidinine-HCl (6M) ou des ions inorganiques comme Cl^-, Br^- ... qui "déstructurent" l'eau et réduisent les attractions apolaires en milieu aqueux. Les agents chaotropiques peuvent être ajoutés à des milieux de solubilisation contenant des détergents.

Détergents

Les détergents sont les principaux agents de solubilisation utilisés pour extraire les protéines membranaires. Les détergents ont une nature amphiphile qui mime l'action des phospholipides autour des protéines intrinsèques. Ils permettent d'extraire les protéines sans modifier irréversiblement leurs propriétés.

Il existe différentes classes de détergents :

• les détergents non ioniques ou zwitterioniques : les Triton (Triton X-100, Triton X-114), les Tween (Tween-20, Tween-80), les Lubrol , la digitonine
• les détergents anioniques : les sels biliaires (Cholate, Desoxycholate), le SDS (sodium dodecylsulfate)
• les détergents cationiques : bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB)
  
  
  
  L'action du détergent sur la membrane est progressive, elle dépend de la quantité de détergent ajouté. Dans le meilleur des cas, on aboutit à une séparation des fractions lipidiques et protéiques.

Méthodologie d'extraction des protéines membranaires

Utilisation du Triton X-114 pour séparer protéines extrinsèques et protéines intrinsèques

Le Triton X-114 est un détergent non ionique avec un caractère hydrophobe marqué.

Les protéines intrinsèques isolées dans la phase inférieure peuvent être dénaturées par l'excès de détergent car la concentration du Triton X-114 est importante.

Solubilisation des protéines périphériques :

• exemple de la F₁-ATP ase mitochondriale
• exemple de la membrane des érythrocytes

Identification des protéines ancrées grâce au phosphatidylinositol (protéines GPI)

Identification des protéines conjuguées aux lipides

Les lipides d'accrochage peuvent être l'acide myristique (C 14:0), l'acide palmitique (C16:0), le farnésol (C15) ou le geranyl-geranol (C20).

Séparation et purification, dosage des protéines

Techniques de séparation et purification

Centrifugation

A l'étape de séparation des protéines, la technique de centrifugation va essentiellemnt servir à discriminer protéines solubilisées (protéines extrinsèques obtenues après un traitement salin par exemple) de protéines insolubles de la fraction membranaire. Le critère de séparation habituellement retenu est : après une centrigugation à 105 000 g pendant 60 min , les protéines solubles sont dans le surnageant.

Dialyse

La dialyse à l'équilibre peut permettre d'éliminer les ions présents dans le milieu d'isolement et elle est parfois utilisée pour éliminer les détergents employés pour la solubilisation. L'efficacité de la dialyse pour éliminer le détergent dépend à la fois de la concentration micellaire critique (CMC) et de la masse molaire des micelles formées par le détergent. Pour que le détergent puisse traverser la membrane à dialyse, il faut qu'il soit sous forme libre donc en dessous de la CMC. Si les micelles formées ont une masse molaire importante, elles resteront dans le sac à dialyse avec le complexe détergent-protéine.

L'élimination du détergent entraîne souvent une agrégation et une précipitation des protéines.
Il est possible d'atteindre plus rapidement l'état d'équilibre de la dialyse en plaçant une substance absorbante dans le compartiment extérieur. Par exemple, l'élimination du sodium dodécylsulfate (SDS) sera favorisée en ajoutant une résine échangeuse d'ions dans le compartiment externe.

Techniques chromatographiques

Les techniques chromatographiques classiques (échanges d'ions, gel exclusion) peuvent être utilisées. La chromatographie d'affinité est utilisée dans des cas où un ligand spécifique de la protéine peut être gréffé sur une résine.

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide des protéines-SDS (SDS-PAGE)

L'électrophorèse est réalisée dans un gel de poyacrylamide contenu entre 2 plaques de verre. Le gel est constitué par 2 couches superposées : un gel de concentration (stacking gel) à pH 6.8 et un gel de séparation (resolving gel) à pH 8.8.

Quand les protéines membranaires sont solubilisées à l'aide du SDS, le détergent entoure la protéine et masque bien évidemment la charge électrique de la protéine en la remplaçant par sa propre charge négative. Il se fixe en moyenne 1.4 g de SDS par g de protéines. Ce n'est donc plus la charge électrique nette de la protéine qui intervient dans la séparation, pas plus d'ailleurs que la charge négative portée par le complexe SDS-protéine, mais la taille moléculaire du complexe (le rayon moléculaire réel du complexe).

Le mercaptoéthanol est souvent présent avec le SDS dans le milieu de solubilisation de l'échantillon comme réducteur pour rompre les ponts disulfure.

La concentration de l'acrylamide (+ bis-acrylamide), les monomères utilisés pour la préparation du gel par polymérisation détermine le domaine de résolution (sur la base de la taille) pour la séparation des protéines

Après l'électrophorèse la détection des bandes se fait par coloration avec le bleu de Coomassie, avec la coloration à l'argent, avec le colorant acide periodique-base de Schiff pour les glycoprotéines ou encore par détection de radioisotopes.

Western blotting ou immunoblotting

Il s'agit d'une methode de détection trés sélective pour une protéine donnée et d'une très grande sensibilité. Le gel d'électrophorèse est mis en contact avec une matrice (membrane) de transfert et un courant perpandiculaire au système est appliqué pour permette un déplacement des protéines du gel vers la membrane de nitrocellulose. On fixe alors un anticorps (anticorps primaire) sur la protéine étudiée. L'anticorps fixé est détecté à l'aide d'un anticorps secondaire coloré, fluorescent ou radioactif.

Isoélectrofocalisation (IEF) et électrophorèse bidimensionnelle

Dans l'isoélectrofocalisation, les protéines sont séparées dans un gel à large pore dans un gradient de pH en fonction de leur point isoélectrique. Le gradient de pH est obtenu en mélangeant des "ampholytes" de point isélectrique connu.

L'isoélectrofocalisation se réalise dans des tubes contenant le gel ou sur des bandes étroites de gel. Après l'opération, la bande de gel (ou le boudin) est transférée au sommet d'un gel d'électrophorèse , elle est placée perpandiculairement à la direction du courant. La deuxième opération est une électrophorèse sur gel de polyacylamide en présence de SDS.

C'est une technique très résolutive : on peut séparer jusqu'à 70 protéines à partir de membrane plasmique d'hépatocytes.

Techniques de dosage des protéines

Le dosage des protéines est un élement essentiel dans les méthodes analytiques parce que, d'une part il est nécessaire de connaître avec précision la quantité de protéines récupérées à chaque étape de purification et que d'autre part, de nombreux résultats d'analyse sont exprimés ou de nombreuses conditions d'expérience sont définies par mg de protéines.
Les techniques de dosage sont des techniques colorimétriques simples. La difficulté tient aux interférences qui peuvent être introduites par les produits chimiques nécessaires à l'isolement des protéines ou à leur purification.

• Absorbance à 280 nm
• Méthode du biuret
• Technique de Lowry (avec le réactif de Folin-Ciocalteu)
• Technique à l'acide bicinchoninic (BCA)
• Technique de Bradford au bleu de Coomassie
  
  

  Méthode	Sensibilité en mg de protéines dosées	Type de méthode	Variation en fonction de la composition en acides aminé	Commentaires (-) ou (+)
  Absorbance à 280 nm	0.05-2	non destructive	importante	(-) Interferences en UV avec de nombreux composés (+) Instantanée
  Biuret	0.05-5	destructive	faible	(-)Emploi de soude concentrée (-) Interférence avec NH4+ (+) Rapidité de la coloration
  Lowry	0.05-0.5	destructive	modérée	(-) Nombreuses interférences (-) Coloration lente
  Bradford	0.01-0.05	destructive	modérée	(-) Emploi d'acide concentré (-) Adsorption du colorant sur le verre (+) Rapide
  BCA	0.005-0.05	destructive	modérée	(-) Incubation longue (-) Chauffage nécessaire

Techniques d'étude de la structure des protéines

Détermination de la masse molaire

• Electrophorèse
• Chromatographie liquide à haute pression
• Diffusion de la lumière
• Ultracentrifigation
• Viscosimétrie
• Osmométrie
  
  

• Cristallisation des protéines membranaires
  La cristallisation est une étape indispensable pour réaliser une étude structurale par rayons X qui permettra de déterminer la structure tertiaire. La cristallisation des protéines membranaires est une opération beaucoup plus difficile que la cristallisation des protéines solubles. Quelques protéines membranaires ont été cristallisées.
  
  La cristallisation se fait à partir de solutions sursaturées dans lesquelles les mouvements aléatoires amènent des collisions entre protéines. Certaines de ces collisions d'une molécule avec une autre molécule se font avec un angle de contact favorable à une agrégation intermoléculaire ordonnée qui aboutira à la formation d'un cristal. Les cristaux de protéines se forment très lentement.
  
  Pour obtenir une solution sursaturée, on introduit des sels comme le sulfate d'ammonium ou des polymères hydrophiles comme le polyethylene glycol (PEG). En général, l'échantillon protéique est mis dans un tube à dialyse et l'agent de précipitation (PEG de masse molaire supérieure à 8000) est mis dans le compartiemnt externe avec un tampon.
  
  Pour que les études cristallographiques puissent se faire dans de bonnes conditions, il faut que la taille du cristal atteigne O.3 mm dans les trois directions.
  
  
• Prédiction des parties intermembranaires des protéines intrinsèques
  Les parties intermembranaires des protéines intrinsèques sont souvent (mais ce n'est pas obligatoire) des hélices alpha. Les résidus aminoacyl qui permettent d'adopter la configuration en hélices alpha sont des résidus hydrophobes. On peut donc, si on connaît la structure primaire de la protéine, essayer de prévoir à priori les portions de la protéine qui seront transmembranaires.
  
  Pour quantifier la nature hydrophobe d'un segment protéique, on se réfère à une mesure de polarité de chaque résidu aminoacyl en déterminant son énergie libre de transfert d'un milieu apolaire vers un milieu aqueux. Par exemple, le transfert d'une polyarginine d'un milieu hydrophobe vers un milieu aqueux est un processus exergonique (favorable) avec une énergie de - 51.7 kJ / mol alors que le transfert d'une polyphenylalanine est défavorable : +15.5 kJ / mol.
  
  

  Echelle de polarité servant à identifier les résidus aminoacyl transmembranaires d'après D.M.Engelman et al. (1986) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem 15, 321-353
  Résidu	Phe	Met	Ile	Leu	Val	Cys	Trp	Ala	Thr	Gly	Ser	Pro	Tyr	His	Gln	Asn	Glu	Lys	Asp	Arg
  DG de transfert kJ/mol	15.5	14.3	13.0	11.8	10.9	8.4	8.0	6.7	5.0	4.2	2.5	-0.8	-2.9	-12.6	-17.2	-20.2	-34.4	-37.0	-38.6	-51.7

  
  La couche interne hydrocarbonée de la membrane a une épaisseur de 3 nm, ce qui correspond à 20 résidus aminoacyl.
  
  A partir de la séquence de la protéine, le calcul de l'index d'hydrophobicité moyen est fait sur les 20 premiers résidus, puis sur les résidus 2-21, puis sur les résidus 3-22 et ainsi de suite. On appelle "fenêtre" ce groupe de 20 résidus. On établit un tracé de l'index d'hydrophobicité en fonction de la position des résidus . La présence de pics sur le diagramme indique la possibilté de partie transmembranaires hélicoïdales. Cependant, ce n'est qu'un argument et non une preuve car certaines protéines solubles ont aussi des fenêtres très hydrophobes et certaines protéines transmembranaires n'ont pas d'hélices alpha mais des feuillets bêta.
  
  

Glycoconjugués

Glycolipides

Extraction

L'extraction des glycolipides se fait par le mélange {chloroforme / méthanol (2/1, v/v) + 0.2 vol de KCl 0.1 M}. Il se forme 2 phases. Les gangliosides sont dans la phase aqueuse supérieure, les autres glycolipides (neutres ou portant une charge) sont dans la phase organique inférieure.

Les glycolipides présents dans la phase inférieure doivent être acétylés pour pouvoir être séparés des autres classes de lipides (cholestérol et phospholides). L'acétylation va augmenter le charactère hydrophobe du glycolipide. Après acétylation (par l'anhydride acétique dans la pyridine), les lipides de la phase inférieure sont séparés sur une colonne de florisil et élués par des solvants de polarité croissante. Le cholestérol est élué en premier, suivi par les glycolipides puis par les phospholipides.

Les techniques d'extraction des gangliosides sont variables selon les besoins : par chromatographie en phase reverse ou sur colonne de DEAE-Sephadex.

Séparation et analyse

Le fractionnement se fait par chromatographie sur couche mince avec le mélange CHCl₃/ CH₃OH / 0.5% CaCl₂ (60:40:9 v/v/v) comme éluant. La détection sur les plaques se fait en pulvérisant un réactif à l'orcinol (0.2% dans H2SO4 2 M) . L'orcinol est un colorant des glucides. La coloration se manifeste après chauffage à 120°C.

Glycoprotéines

Extraction et séparation

A partir d'un extrait protéique brut, le passage sur une colonne de chromatographie d'affinité sur laquelle sont greffées des lectines permett de séparer et de concentrer les glycoprotéines sur la base de la composition de leur partie glycosylée.

Après l'étape de chromatographie d'affinité, il est courant de faire une filtration sur gel ou un échange d'ions pour les glycoprotéines chargées.

Séparation des chaînes oligosaccharidiques

Les chaînes oligosaccharidiques sont détachées chimiquement (hydrazinolyse) ou enzymatiquement par une N-glycosidase pour les liaisons N-glycosidique ou par une O-glycosidase pour les liaisons O-glycosidique.

L'analyse de la séquence de la chaîne oligosaccharidique peut se faire par spectrographie de masse ou /et RMN, mais peut aussi se faire par traitement enzymatique d'hydrolyse spécifique par des glycosidases appropriées ( sialidase, a-D-galactosidase, b-D-galactosidase, a-D-mannosidase...)

Caractéristaion et quantification des oses

Il existe un panel de réactions colorées plus ou moins spécifiques pour doser les sucres totaux (réactif à l'anthrone) ou les oses (orcinol) ou leurs dérivés.