Méthylation des acides gras

Les acides gras sont convertis en leur esters méthyliques qui sont des composés volatiles.

Réactifs :

• Acide sulfurique 1%
• Diethylether
• Chloroforme
• Azote comprimé

Protocole expérimental :

1. Ajouter 4 mL d'acide sulfurique à 1% à 2 mL de lipides totaux
2. Chauffer à 90°C pendant 90 min. sous atmosphère d'azote
3. Laisser refroidir à température ambiante. Ajouter 5 mL d'eau distillée
4. Extraire les esters méthyliques par 3 mL de diethyether. Agiter doucement. Il se forme 2 phases. Laisser les phases se séparer.
5. Récuper soigneusement la phase supérieure organique (elle contient les esters méthyliques)
6. Répéter les opérations 4 et 5 et combiner les phases supérieures obtenues à chaque extraction.
7. Evaporer l'ether éthylique en utilisant un courant d'azote. Travailler sous la hotte !
8. Redissoudre les esters méthyliques dans 200 µL de chloroforme.

Purification des esters méthyliques d'acides gras par CCM

1. Déposer dans le coin gauche de la plaque un spot de 10 µL du mélange d'esters méthyliques (témoin pour la révélation)
2. Déposer le reste de l'échantillon en bande sur la plaque.
3. Faire migrer le solvant (hexane : diethylether 80 : 20 , v/v).
4. Quand le front du solvant est à 1 cm du bord supérieur, sortir la plaque et la sècher.
5. Couvrir la partie de la plaque qui a servi à la migration de l'échantillon avec une feuille de papier en laisssant à découvert la zone témoin
6. Mettre quelques cristaux d'iode dans une pipette de 10 mL et souffler de l'air (ou de l'azote) sur la plaque à travers la pipette.
7. Repèrer rapidement la zone où sont les esters méthyliques (au milieu de la plaque). Entourer la zone au crayon.
8. Gratter le gel de silice de la zone marquée avec un cutter ou une lame de razoir.
9. Transférer la poudre dans un tube en verre et extraire avec 3 mL de diethylether.
10. Recommencer l'étape 9 quatre fois.Evaporer l'éther.
11. Conserver les échantillons à -20°C.
    
    

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