Méthode d'extraction des lipides membranaires dérivée de la méthode de Folch et al.

Les lipides sont extraits par un mélange de solvants : [CHCl₃ / CH₃OH 2:1 (v/v)]. Une solution saline [KCl 0.88 % (p/v)] est ajoutée afin d'obtenir 2 phases. La phase organique inférieure contient tous les lipides exceptés les gangliosides. Les gangliosides, étant plus hydrophiles du fait de leur importante partie glycosylée, sont dans la phase aqueuse.

Les fractions membranaires étudiées sont génerallement utilisées en faible quantité (faible volume). Le matériel d'extraction est adapté à ces conditions particulières.

Appareillage et réactifs

• Broyeur type Potter
• Tubes à centrifuger en verre
• Eprouvette en verre
• Centrifugeuse
• Evaporateur rotatif
• Azote comprimé
• CHCl₃
• CH₃OH
• KCl 0.88% (p/v)
  
  

Protocol expérimental

• Ajouter 1vol. de méthanol à 1 vol. de fraction membranaire directement dans le bol du Potter. Homogénéiser le mélange.
• Ajouter 2 vol. de chloroforme. Homogénéiser soigneusement le mélange.
• L'homogénat doit constituer une seule phase. Si ce n'est pas le cas, ajouter le mélange [CHCl₃ / CH₃OH 2:1 (v/v)] en quantité suffisante pour obtenir une phase.
• Si les protéines dénaturées sont abondantes, centrifuger pour les éliminer. Récupérer soigneusement le surnageant.
• Ajouter ensuite KCl 0.88% (p/v) à raison de 1/4 du volume total de la phase (ou du surnageant).
• Homogénéiser le mélange.
• Transvaser dans un tube à centrifuger. On obtient un mélange turbide.
• Centrifuger pour séparer rapidement les phases. Faute de disposer d'une centrifugeuse, on peut laisser décanter.
• On obtient éventuellement un précipité de protéines à l'interface entre les 2 phases.
• Eliminer la phase supérieure et l'interphase.
  • ! Conserver la phase supérieure si l'extraction des gangliosides est envisagée.
• Laver la phase organique avec un mélange eau / méthanol (2:1 v/v) à raison de 0.25 vol. par vol. de phase organique. Récuper la phase organique inférieure.
• Evaporer les solvants à l'aide d'un évaporateur rotatif (purger l'air dans l'appareil avec un courant d'azote avant la mise en route)
• Solubiliser les lipides dans un petit volume de CHCl₃ (1 mL de solvant pour 10 mg de lipides).
• Conserver à -20°C dans un flacon hermétiquement fermé et purgé à l'azote.

Précautions particulières :

1. Si la conservation doit être faite sur une longue période, il est conseillé d'ajouter 0.005% de BHT (butyl hydroxytoluène)
2. Utiliser des solvants très purs (ou redistillés)
3. Eviter d'utiliser du matériel en plastique pour l'extraction : des polymères de faible masse molaire ou des oxydants contaminants peuvent être extraits par les solvants
4. Si la fraction membranaire utilisée provient de plantes, attention aux phospholipases ! Les phospholipases de plantes sont très résistantes et sont même activées par certains solvants comme le méthanol ou l'éther éthylique. Il est nécessaire de les dénaturer par traitement à l'eau bouillante ou au méthanol chaud avant l'étape d'extraction.
   
   

Polarité des solvants

Le solvant idéal (ou le mélange de solvants) doit être suffisamment polaire pour extraire tous les lipides mais pas trop. Si il est trop polaire les lipides neutres (cholestérol, triacylglycérols) seront peu ou mal extraits. Il est nécessaire de choisir le solvant en fonction de l'objectif d'analyse.

La polarité du solvant est mesurée par sa constante diélectrique.

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