Le modèle de membrane actuellement admis est celui de Singer et Nicolson dit de la "mosaïque fluide". Les deux concepts qui sous-tendent ce modèle sont les suivants :
Toutes les membranes biologiques sont asymétriques. L'asymétrie se manifeste aussi bien au niveau de la structure (organisation spatiale des constituants) qu'au niveau de la fonction (activités catalytiques différentes sur les deux faces de la membrane).
Après leur synthèse au niveau du reticulum endoplasmique, les protéines destinées aux membranes sont exportées de manière ciblée (par un mécanisme appelé adressage) et sont insérées de manière asymétrique dans la membrane. |
| Les lipides sont distribués asymétriquement. Leur site de biosynthèse est la couche externe de la membrane du reticulum endoplasmique. Cependant, ils peuvent se redistribuer entre les deux couches de la membrane par diffusion transversale ou mouvement flip-flop. Seuls les glycolipides ont une asymétrie absolue : ils sont insérés dans une des couches de la membrane et ils y restent. |
Structure spatiale des phospholipides
| Les phospholipides sont des composés amphiphiles qui possèdent une tête polaire et deux queues hydrophobes. |
L'encombrement stérique relatif de la tête polaire par rapport à la partie hydrophobe permet d'imaginer differents types de structure.
L'insaturation de la chaîne paraffinique (qui introduit une courbure dans la chaîne) ainsi que le degré d'hydratation de la partie polaire sont des facteurs déterminants. Par exemple, la couche d'hydratation de la tête polaire de la phosphatidylcholine est constituée par environ 20 molécules d'eau alors que celle de la phosphatidyléthanolamine n'en comporte que 5. La phosphatidylethanolamine adopte une configuration en cylindre (encombrement stérique de la tête polaire comparable à celui de la queue hydrophobe) alors que la phosphatidylcholine adopte une configuration en cône inversé.
L'élimination d'une chaîne hydrophobe, comme c'est le cas dans la forme lyso, se répercute bien évidemment sur la forme du phospholipide : la lysophosphatidyléthanolamine aura une configuration en cône.
| Lipide ayant une seule queue hydrophobe
et une grosse tête polaire. exemple : lysophosphatidylcholine |
Lipide ayant une seule queue hydrophobe et une
petite tête polaire. |
Lipide avec 2 queues hydrophobes, une
grosse tête polaire et des chaînes fluides. exemples : phosphatidylcholine, phosphatidylsérine , phosphatidylglycérol , phosphatidylinositol , sphingomyéline |
Lipide avec 2 queues hydrophobes, une
petite tête polaire. exemples : phosphatidylethanolamine , phosphatidylsérine + Ca++ |
Lipide avec 2 queues hydrophobes, une
petite tête polaire, lipides non ioniques,queues hydrophobes poly(cis)insaturées. exemples : phosphatidylethanolamine insaturée, acide phosphatidique + Ca++ , cholestérol |
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cône |
cône tronqué | cône tronqué | cylindre | |
Structure des associations de phospholipides
En fonction de leurs structures spatiales, les phospholipides vont s'associer en différents types d'organisation. Les types les plus courants seront : une organisation lamellaire en bicouches (notée La , L alpha), une organisation en micelles cylindriques (notée HI ), une organisation en micelles cylindriques inverses regroupées avec une symétrie hexagonale (notée HII ).
| Micelle sphérique | Micelle cylindrique | Bicouche flexible Vésicules |
Bicouche plane | Micelles cylindriques inversées Organisation en phases hexagonales |
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Pour un lipide donné, la structure adoptée
dépend de deux paramètres : la teneur en eau du mélange
(% lipide /eau) et la température. H : phase hexagonale ; L : phase lamellaire ; P : lamellaire ridé ; Q : phase cubique. |
Selon la nature du phospholipide, donc selon sa structure spatiale, à la température de 37°C et à une teneur en eau assez élévée (ce qui correspond aux conditions physiologiques des mammifères), un phospholipide conduira à une organisation associative pour donner une supra-structure déterminée.
Techniques permettant la mise en évidence des structures spatiales
Il s'agit de méthodes physiques telles que la diffraction des rayons X, la diffraction neutronique, la RMN du phosphore-31, la microscopie électronique après cryofracture.
Le principe de base dans l'étude de la distribution transversale (appartenance au feuillet externe ou au feuillet interne de la bicouche) des lipides est simple. Les phospholipides, qui sont marqués par une sonde (un marqueur chimique coloré, fluorescent ou radioactif) qui ne traverse pas la membrane, ont nécessairement leur tête polaire située sur la couche externe de la membrane. Inversement les lipides qui seront marqués seulement après perméabilisation de la membrane, sont situés dans la couche interne de la membrane.
Ceci implique que :
Mise en évidence de la distribution des lipides dans les deux feuillets
L'étude de la distribution des lipides sur les 2 feuillets de la membrane peut se faire en utilisant des marqueurs chimiques des phospholipides ou en traitant les membranes ou les vésicules membranaires par des enzymes : phospholipases, protéines de transfert des phospholipides ou mise en évidence d'une activité prothrombinase
Les sondes chimiques utilisées correspondent essentiellement à des marqueurs de la fonction amine capables de réagir avec des phospholipides aminés, c'est à dire la phosphatidyléthanolamine (PE) et le phosphatidylsérine (PS).
Le trinitrobenzène sulfonate (TNBS), appelé encore picryl sulfonate, forme un produit stable et coloré en jaune après réaction avec les fonctions amine. La fluorescamine peut être utilisée de la même façon en donnant un marquage fluorescent.
Comment marquer les membranes avec le TNBS ?
Contrôles :
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L'éthylacetimidate (marqué au carbone-14)
est également un réactif qui réagit avec les groupes aminés
et qui est impénétrant alors que le dérivé isothionylacetimidate
réagit lui aussi avec les groupes aminés libres mais il est pénétrant.
La comparaison des marquages obtenus avec les 2 composés permet de définir
la localisation des phospholipides dans les couches de la membrane.
L'action de différentes phospholipases sur les
lipides membranaires permet également d'étudier la disposition
dans les feuillets de la bicouche. Les phospholipases disponibles commercialement
ont des sites de coupure précis.
Ces phospholipases sont la phospholipase
A1, la phospholipase A2, la phospholipase C, la phospholipase D, la sphingomyélinase
et une phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol.
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Comment réaliser les expériences de coupure de phospholipides avec une phospholipase ? Les expériences avec les phospholipases impliquent les étapes suivantes :
Contrôles :
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Méthode spécifique pour étudier la distribution de la phosphatidylsérine La phosphatidylsérine membranaire peut agir comme activateur de la "cascade de coagulation". La "cascade de coagulation" est une série
de réactions qui impliquent de nombreux facteurs. Dans les dernières
étapes de la cascade enzymatique, la prothrombine est transformée
en thrombine. La thrombine formée catalyse la transformation du
fibrinogène en fibrine. Les molécules de fibrine s'associent
pour former un caillot. In vivo, le transfert de la phosphatidylsérine
dans la couche externe de la membrane des plaquettes provoque une activation
de la thrombine, c'est à dire catalyse la réaction prothrombine
=> thrombine . La quantité totale de phosphatidylsérine membranaire est dosée (par dosage du phosphore) après extraction et séparation des phospholipides par chromatographie sur couche mince. La quantité de phosphatidylsérine exposée sur la face externe de la membrane est estimée à partir de la quantité de thrombine formée. |
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Le cholestérol membranaire La quantité de cholestérol dans le feuillet externe d'une bicouche d'une membrane cellulaire ou d'une vésicule membranaire est déterminée en étudiant l'accessibilité des molécules de cholestérol à l'enzyme cholestérol oxydase. Le cholestérol est transformé enzymatiquement en cholesténone qui absorbe à 235 nm. Les différentes études conduites sur les membranes ont montré que la quasi totalité du cholestérol est accessible à l'enzyme (90% du cholestérol est oxydé). Le cholestérol est donc principalement présent sur la face externe des membranes cellulaires. Cependant, le cholestérol est capable de migrer rapidement d'un feuillet à l'autre ( la demi-vie est inférieure à 1 min). |
Les protéines d'échange des phospholipides (PEPL) catalysent l'échange 1 pour 1 des molécules de phospholipides entre 2 membranes. Cet échange concerne les phospholipides de la couche externe de la membrane et l'échange n'affecte pas l'intégrité de la membrane. Les PEPL sont classées selon leur spécificité :
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Les lipides membranaires sont marqués in vivo par injection chez l'animal d'un précurseur radioactif (3H-glycerol , 3H-choline, 3H-oléate...). Les liposomes (SUV) fabriqués par exemple à partir d'un mélange de phosphatidylcholine et d'acide phosphatidique(98 : 1 , p/p) sont souvent utilisés comme membranes réceptrices. On admet que dans le SUV les 2/3 de PC sont dans le feuillet externe. On peut calculer le pool PC échangeable de la membrane : dpm transferrés = {PC lipo / (PC lipo + PC donneur)} x (PC out / PC donneur) x dpm total PC lipo est le pool PC échangeable dans
les liposomes (soit 2/3 de PC total du liposome). |
Les mouvements des lipides dans la membrane
L'origine de l'asymétrie repose sur la biosynthèse
vectorielle des lipides. Les lipides sont synthétisés, étape
par étape, dans le reticulum endoplasmique par des enzymes localisées
du côté cytosolique de la membrane. D'abord 2 acides gras activés,
enchassés dans le feuillet externe de la membrane, sont attachés
au glycérol phosphate puis la tête polaire est accrochée.
Donc, tous les lipides synthétisés sont initialement insérés
dans le feuillet externe des membranes du reticulum endoplasmique.
Néanmoins, on constate une diffusion transversale rapide des lipides
entre les 2 feuillets de la membrane du reticulum endoplasmique. Cette diffusion
est rendue possible par l'existence d'enzymes capables de transporter des phospholipides.
Ces enzymes sont appelées "flippase".
| Une flippase permet le passage d'un phospholipide d'un feuillet à l'autre de la membrane. |
Les flippases sont des ATPases. Une flippase spécifique pour la phosphatidylsérine est présente dans la membrane des erythrocytes. Elle ne fonctionne qu'en présence d'ATP, est activée par les ions Mg++, est inhibée par les réactifs des thiol (N-ethylmaleimide).
Le transport intracellulaire des lipides est très
complexe. Il y a des mouvements à travers les membranes et des tranferts
entre différentes membranes dans les 2 sens : des membranes du reticulum
endoplasmique à la membrane plasmique et inversement.
Le transport des lipides met en jeu 3 types de processus.
Mise en évidence des mouvements transversaux (mouvements flip-flop)
Si les vitesses de diffusion transversale des lipides sont faibles dans les membranes qui ne sont pas le siège de synthèse lipidique (exemple dans la membrane des érytrocytes), elles sont beaucoup plus importantes dans les membranes qui synthétisent les lipides (reticulum endoplasmique).
Le principe de la mesure du transfert est simple : les lipides d'un feuillet sont marqués (marquage radioactif, marqueurs de spin ou marqueurs fluorescents) ; le transfert des lipides marqués d'un feuillet à l'autre est déterminé par une technique appropriée.
La résonance paramagnétique électronique (RPE) est une des techniques utilisées pour mettre en évidence les mouvements flip-flop des lipides. Il est nécessaire de greffer des molécules paramagnétiques (marqueurs de spin) sur les lipides membranaires. Une molécule paramagnétique possède un électron non apparié. Les molécules fréquemment utilisées possèdent des radicaux nitroxyde. On greffe la molécule sur un lipide.
Quel est le principe des mesures de résonance paramagnétique électronique ? En présence d'un champ magnétique externe, le moment magnétique peut prendre 2 orientations possibles, correspondant aux 2 états de spin (+1/2 et -1/2). Les 2 états ont des énergies différentes et on peut passer d' un état à l'autre avec une radiation électromagnétique (hu) correspond à l'énergie de transition. Les spectres d'absorption obtenus donne des renseignements sur les mouvements et l'environnement de la sonde. Les dérivés nitroxyde présentent 3 pics dus à l'interaction entre le spin de l'électron célibataire et le spin du noyau de l'azote. |
Comment mettre en évidence le mouvement transmembranaire d'un lipide à l'aide de la résonance paramagnétique électronique ? Cette expérience décrit la mise en évidence d'un mouvement flip-flop naturel (non médié enzymatiquement) dans des liposomes. Les liposomes sont marqués par un radical nitroxyde pendant leur préparation. L'addition d'un réducteur non pénétrant (ascorbate) provoque un quenching de 50% du signal (le marquage du feuillet externe est supprimé). L'incubation à 37°C pendant un temps suffisamment long permet un mouvement de migration des phospholides marqués du feuillet interne vers le feuillet externe. L'addition du réducteur permet de diminuer à nouveau le signal. Si l'opération est répétée plusieurs fois, c'est l'ensemble du signal RPE qui sera supprimé. |
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Comment mettre en évidence le mouvement transmembranaire d'un lipide à l'aide des protéines échangeuses de phospholipides (PEPL) ?
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| Etape 1 On prépare des liposomes possédant un type de phospholipide marqué |
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Etape2 La protéine catalyse un échange 1 pour 1 entre les liposomes et le feuillet externe de la membrane.
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Etape 3
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Etape 4 |
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Etape5 On effectue des dosages comparatifs avant action de la phospholipase et après action de la phospholipase.
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Mise en évidence des mouvements latéraux
Les lipides diffusent rapidement dans le plan de la membrane
selon un processus appelé diffusion latérale.
La principale méthode permettant de déterminer
les coefficients de diffusion des lipides dans le plan de la membrane est une
méthode de fluorescence : la FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching).
Cette technique nécessite l'incorporation d'un fluorophore dans la membrane et l'utilisation de cellules ou d'organites de taille importante car la détection de fluorescence se fait à l'aide d'un microscope de fluorescence après fixation de la cellule sur une lame de microscope.
Une petite surface (diamètre environ 1µm) est décolorée (bleached) par un faisceau laser intense (le fluorophore est détruit par la lumière intense). La fluorescence se manifeste à nouveau en fonction du temps dans la zone étudiée du fait de la migration latérale des lipides marqués par le fluorophore. Le coefficient de diffusion est inversement proportionnel au t 1/2 de la récupération de fluorescence. |
Comportement thermique des lipides membranaires
Il existe une grande différence d'énergie
entre l'interaction entre les têtes polaires entre-elles et l'interaction
des chaînes hydrocarbonées entre-elles. Quand on élève
la température, les interactions entre les chaînes hydrocarbonées
hydrophobes sont rompues bien avant celles qui existent entre les têtes
polaires. Les interactions entre têtes polaires se font avec une énergie
plus forte que celles des chaînes paraffiniques : liaisons électrostatiques
et liaisons hydrogène.
Il n'y a pas de changement brutal solide-liquide mais une série de transitions
dans l'architecture des associations moléculaires.
La calorimétrie différentielle permet de mesurer les températures des transition ainsi que les quantités de chaleur mises en jeu.
La température de transition de phase (Tfusion) dépend de 3 facteurs principaux :
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La fluidité de la membrane
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La fluidité est le reflet des possibilités de mouvement des constituants de la membrane (lipides et protéines) dans le plan de la membrane. Les interactions entre les molécules de lipides déterminent le degré de liberté de mouvement de chacune des molécules.
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| La présence d' une double liaison augmente la liberté de mouvement de la chaîne. | |
| La présence de cholestérol a un effet inverse : les chaînes sont rigidifiées à cause des interactions hydrophobes entre les chaînes paraffiniques et les cycles du cholestérol. |
Une définition précise du concept "fluidité" dans un milieu hétérogène comme l'est la membrane n'est pas possible. On se contente de représenter expérimentalement la fluidité par la mesure d'un paramètre physique qui peut lui être associé.
Deux types de techniques physiques sont utilisées pour accéder aux paramètres liés à la fluidité. Il s'agit de l'étude de la dépolarisation de fluorescence et l'étude des spectres de résonance paramagnétique électronique.
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Quel est le principe de la mesure de viscosité du milieu par dépolarisation de fluorescence ? Si on envoie une lumière polarisée sur un ensemble de molécules, l'absorption optimale de la lumière sera pour les molécules dont le moment dipolaire est parallèle au plan de polarisation du rayonnement (photosélection). Seules ces molécules seront excitées. Les molécules excitées vont se désexciter en émettant un rayonnement de fluorescence. On mesure l'intensité du rayonnement émis dans 2 directions perpendiculaires à la direction du faisceau incident (I parallèle et I perpendiculaire). Selon la viscosité du milieu, on obtiendra un rapport différent entre ces 2 grandeurs . Si le milieu est fluide: I parallèle = I perpendiculaire. Si le milieu est visqueux : I parallèle >I perpendiculaire. |
| Comment mesure-t-on la polarisation de fluorescence ? |
| Comment estimer la fluidité par mesure de la dépolarisation de fluorescence ? |
Première étape : On marque certains phospholipides de la membrane par des composés fluorophores. |
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Deuxième étape : On détermine le coefficient d'anisotropie r à partir des mesures d'intensité de fluorescence dans les 2 directions : I parallèle et I perpendiculaire. La décroissance de r en fonction du temps sera d'autant plus faible que le milieu est visqueux. |
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La surface de la membrane ressemble à une mosaïque. Les protéines sont dispersées dans une matrice de lipides. La répartition des lipides et des protéines ne tient pas du hasard. Les protéines sont souvent entrourées de lipides spécifiques et les lipides sont souvent regroupés en domaines lipidiques.
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Une membrane contient de nombreuses protéines différentes (de 12 à 50). Les protéines ne sont pas distribuées au hasard dans la bicouche mais occupent des positions déterminées. Les protéines membranaires sont disposées de manière asymétrique dans la bicouche. |
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L'intégration des protéines dans la bicouche peut prendre différentes formes. Pour prédire, à partir de la séquence de la protéine, les fragments hydrophobes des protéines qui pourront constituer la partie enchassée dans la membrane, on a défini une échelle d'hydrophobicité. |
Pour déterminer expérimentalement l'orientation d'une protéine dans la membrane, on traite la membrane par un agent non pénétrant (enzyme ou marqueur chimique coloré, fluorescent ou radioactif) qui modifie les protéines.
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Comment montrer la distribution des protéines sur la face externe de la membrane plasmique à l'aide d'une protéase ? Dans l'exemple traité, seules 4 protéines sont considérées. Parmi les 4, il y a une glycoprotéine. Après électrophorèse sur gel de polyacrylamide et révélation au bleu de Coomassie, on détecte les 4 protéines. Après coloration avec formation d'une base de Schiff, on détecte la partie glucidique de la glycoprotéine. La protéase utilisée est la trypsine (enzyme non pénétrante). Etape 1: Témoin : membrane non traitée Etape 2 : Cellule traitée par la trypsine Etape 3 : Cellule perméabilisée
traitée par la trypsine |
Les techniques microscopiques de cryodécapage permettent de visualiser après ombrage la surface de la membrane. On peut identifier les zones occupées par les protéines à partir de l'image de la surface membranaire.
Il n'a pas été démontré que les protéines pouvaient basculer par un mouvement flip-flop dans l'épaisseur de la membrane. Les contraintes énergétiques pour un tel mouvement sont beaucoup trop importantes. Seuls les mouvements latéraux de diffusion dans le plan de la membrane sont possibles.
Etude des mouvements latéraux
Les protéines, tout comme les lipides sont mobiles dans le plan de la membrane (diffusion latérale). La mise en évidence des mouvements latéraux se fait la technique de FRAP comme cela a été décrit pour les lipides.
Les mouvements des protéines dans la membrane (ouverture et fermeture des canaux)
La dynamique des protéines n'est pas exclusivement représentée par des mouvements de déplacement latéral dans la matrice lipidique mais elle aussi illustrée par les changements conformationnels importants associés au fonctionnement des systèmes, par exemple l'ouverture et la fermeture des canaux.