ANALYSE DE LA STRUCTURE PRIMAIRE DES PROTEINES

1. Introduction

La protéine étudiée doit être pure. La détermination de la séquence nécessite de résoudre deux problèmes:

1- La composition brute, c'est à dire déterminer la nature des résidus et leur nombre. Il est donc nécessaire de faire une hydrolyse totale de la protéine puis de séparer les acides aminés les uns des autres par une technique adéquate (Techniques de séparation des molécules et macromolécules) et de les doser (Acides aminés, Techniques de dosage par spectroscopie UV et visible).

2- La séquence c'est à dire l'ordre d'enchaînement des résidus aminoacycles dans la macromolécule.

2. Stratégie de l'analyse

On suit une méthode qui permet d'avancer par étapes successives dans la connaissance de la séquence.
Il est préconisé d'opérer comme suit :

1- Rompre les liaisons disulfure par un réducteur. En général on utilise le mercaptoéthanol : HO-CH₂-CH₂-SH)

2- Les thiols (-SH) libérés sont alkylés pour les empêcher de reformer des ponts disulfure . En général, on utilise l'iodoacétate de sodium ou la N-ethylmaleimide pour réaliser la réaction d'alkylation

3- Déterminer la composition en amino-acides de la protéine après hydrolyse totale de la protéine (HCl 6M ou 12M pendant 6 à 12h)

4- Séparer des AA par résine échangeuse d'ions et quantifier chaque résidu (composition en acides aminés)

5- Identifier le résidu N-terminal et le résidu C-terminal ( utilisation des séquenceurs par application de la méthode récurrente d'Edman . Le résidu N-terminal peut également être marqué par le fluorodinitrobenzène qui donne un dinitrophényl-aminoacyl de couleur jaune ou par le chlorure de dansyle qui est fluorescent.

6- Hydrolyser les liaisons peptidiques internes soit enzymatiquement à l'aide d'endopeptidases) soit chimiquement (hydrolyse acide dans les conditions douces) pour obtenir des fragments plus petits de peptides.

7- Déterminer la séquence des petits peptides résultants ( identification des extrémités N-terminale et C-terminale (utilisation du séquenceur pour l'extrémité N-terminale)

8- Identifier les parties identiques des différents petits peptides pour reconstituer la séquence de la protéine

9- Localiser les liaisons -S-S-

3. Les différentes possibilités d'hydrolyse des liaisons peptidiques

· Ruptures des liaisons peptidiques par HCl

Par hydrolyse en milieu acide HCl 12M à une température de 110° C pendant 6 à 12 heures. Toutes les liaisons sont rompues et les aides aminés de la protéine sont libérés.

Par hydrolyse en milieu acide HCl 6M pendant 6 heures, une partie seulement des liaisons peptidiques sont rompues. On obtient un mélange d'acides aminés et de petits peptides.

· Ruptures des liaisons peptidiques aux extrémités N et C terminales

Hydrazynolyse : Toutes les liaisons peptidiques sont rompues et les résidus excepté le C terminal sont transformés en hydrazides. L'acide aminé C-terminal est libéré intact.
On utilise cette méthode seulement quand les carboxypeptidases A et B sont sans effet.

Réaction d'Edman : Le réactif utilisé est le phénylisothiocyanate.
La liaison entre le résidu N-terminal et le suivant est cassée. L'acide aminé N-terminal est transformé en Phenylthiohydantoïne (PTH aminoacide) . Il s'agit d'une méthode récurrente. C'est la réaction utilisée dans les séquenceurs d'amino-acides.
La réaction est impossible lorsque N terminal est protégé.

Carboxypeptidase A : Il s'agit d'une exopeptidase qui coupe la liaison peptidique côté N du résidu C-terminal.
Il existe des conditions de spécificité à savoir Rn = Arg, Lys, Pro et Rn-1 = Pro
L'enzyme peut détacher 1 à 4 résidus terminaux.

Carboxypeptidase B : Il s'agit d'une exopeptidase qui coupe la liaison peptidique de côté N du résidu C-terminal.
La spécificité est telle que Rn = Arg, Lys, AECys et Rn-1 = Pro .
L'enzyme détache 1 à 4 résidus terminaux.

· Rupture des liaisons peptidiques internes

Bromure de cyanogène: côté C du residu Rn = Met ; très spécifique

Bromure de cyanogène anhydre: côté C du residu Rn = Met. Trp ; très spécifique

Trypsine: côté C des Rn = Lys, Arg et AminoEthylCys avec R_n+1 = Pro ; très spécifique

Chymotrypsine: côté C des Rn = Phé,Tyr, Trp et Leu et avec comme condition R_n-1 = Pro ; possibilité d'hydrolyser parfois les Rn = Met , Asn et autres

Thermolysine: côté N des Rn = Leu, Ileu,Val,Phé,Tyr, Trp avec comme condition R_n-1 = Pro; possibilité d'hydrolyser parfois les Rn = Ala et autres

Pepsine: côté N des Rn = Leu, Asp, Glu, Phe,Tyr, Trp avec comme condition R_n-1 = Pro; possibilité d'hydrolyser parfois les Rn = Ala et autres