Liposomes

Définition des liposomes

Les liposomes sont des vesicules constituées d'un volume interne aqueux entouré d'une membrane lipidique. Ils se forment spontanément quand des lipides (en général des phospholipides) sont dispersés dans un milieu aqueux. Leur dimension est très variable selon la façon dont ils sont préparés. Leur diamètre peut aller de quelques dizaines de nanomètres à quelques dizaines de microns.

On peut piéger des molécules variées dans un liposome en les stockant dans la phase aqueuse interne si ces molécules sont hydrophiles ou en les solubilisant dans la membrane si elles sont hydrophobes.

Bien qu'étant amphiphiles, tous les phospholipides ne peuvent pas être utilisés pour la fabrication de liposomes. Seuls les phospholipides dont l'encombrement stérique des chaînes hydrocarbonées est voisin de celui de la tête polaire conviendront.

Les liposomes sont utilisés à des fins diverses :

comme membrane modèle dans les "sytèmes reconstitués"
Quand une protéine membranaire a été isolée et purifiée, il faut pour vérifier son bon état de fonctionnement, l'intoduire dans un environnement qui ressemble à celui de son état natif. On incorpore donc cette protéine purifiée dans un liposome et on étudie ses propriétés dans ce nouvel environnement. On peut ainsi étudier le fonctionnement de la protéine isolée et déterminer les caractéristiques de cette dernière par rapport à la nature des lipides proches (certaines protéines ont besoin d'un environnement de lipides spécifiques pour être actives).
comme vecteurs de molécules actives (médicaments, produits cosmétiques...)
Les propriétés de la membrane d'un liposome fabriqué à partir de phospholipides naturels sont très proches des propriétés des membranes naturelles. Ils sont alors sans danger pour les traitements médicaux et ils peuvent véhiculer des médicaments vers les zones à traiter.

Les différents types de liposomes

Les liposomes se différencient en premier lieu par leur composition chimique. Les propriétés telles que la perméabilité, la charge de surface, la fluidité de la membrane dépendront du lipide utilisé pour créer la membrane.

La taille du liposome va dépendre de la technique utilisée pour le fabriquer. Le diamètre peut varier entre quelques dizaines de nanomètres et quelques dizaines de microns, c'est à dire d'un rapport de 1 à 1000.

On distinguera :

les vésicules multilamellaires (multilamellar vesicles : MLV) qui ont un diamètre allant de 0.1µm à 1µm. Les MLV sont constitués de couches membranaires superposées concentriques.

La structure observée ressemble à une coupe transversale d'un oignon.

les petites vésicules unilamellaires (small unilamellar vesicles : SUV) qui ont un diamètre de 15nm-25nm. Ce sont les plus petites structures vesiculaires qui peuvent être obtenues.

les grandes vésicules unilamellaires (large unilamellar vesicles : LUV) qui ont un diamètre de l'ordre du micromètre.

Une catégorie particulièrement interessante de liposomes peut être obtenue en utilisant des lipides extraits d'archaebactéries. Les membranes des archaebactéries sont constituées de glycérophospholipides dont les chaînes carbonées sont liées par des liaisons éther au radical glycéryl et non par des liaisons esters comme c'est le cas pour les glycérophospholipides courants. De plus, les chaînes carbonées sont ramifiées. Ces lipides particuliers confèrent à la membrane des liposomes solidité et résistance par rapport aux conditions extrêmes de température,de pH et/ou de pression auxquelles sont soumises les archaebactéries.

Une autre classe de vésicules semblables aux liposomes est constituée par les niosomes. Les niosomes sont des vésicules fabriquées à partir de surfactants non ioniques et non pas de phospholipides. On utilisera, par exemple, le polyoxyethylene sorbitan stearate (qui a pour non commercial Tween 61) associé à du cholestérol et du dicetylphosphate pour fabriquer des niosomes.

Préparation des liposomes

Toutes les techniques de préparation ont en commun trois étapes : (1) l'évaporation du solvant de la phase lipidique, (2) la dispersion des lipides dans un milieu aqueux, (3) la purification des liposomes formés.
La principale différence entre les techniques de préparation est la manière dont les constituants membranaires sont dispersés dans le milieu aqueux avant la phase de coalescence qui conduit à la formation de la membrane.On rencontrera trois modes de dispersion des phospholipides : la dispersion physique, la dispersion en deux phases et la solubilisation par un détergent.

Nous décrivons ici quelques techniques universelles et simples de préparation des différents types de liposomes.

Solubilisation et stockage des lipides

Les lipides peuvent être conservés sous forme solide ou en solution dans un solvant organique à -20°C ou -70°C de manière à réduire les risques d'oxydation des chaînes carbonées insaturées. Le solvant le plus couramment utilisé est le mélange Chloroforme/Méthanol 2:1 (V/V).

Toutes les solutions lipidiques doivent être conservées à l'obscurité dans les récipients en verre bouchés hermétiquement. Pour éviter l'oxydation par l'air, il est courant d'envoyer un courant d'azote sur la solution lipidique avant de fermer le flacon. Comme l'azote est plus léger que l'air, il faut que le courant gazeux soit suffisamment fort pour déplacer efficacement l'air dans le flacon.

Préparation des "Multilamellar vesicles" (MLV)

L'évaporation du solvant de la solution lipidique conduit à un dépôt de lipides secs sur un support solide . Le support est en général constitué par les parois d'un ballon en verre. La dispersion dans un milieu aqueux accompagnée d'une agitation régulière à une température supérieure à la température de transition de phase du lipide permet d'obtenir des liposomes.Il s'agit là d'un processus de dispersion mécanique par agitation (méthode de Bangham).

Les lécithines sont des phosphatidylcholines que l'on trouve en abondance dans le soja ou dans le jaune d'oeuf. Les phosphatidylcholines sont des ions dipolaires à pH 7. Leur charge électrique globale est nulle.

Le cholesterol est utilisé pour augmenter la rigidité de la membrane.

Le dicetylphosphate est une molécule amphiphile chargée négativement . Il sera incorporé dans la membrane du liposome. Il conferera aux liposmes une charge de surface négative qui permettra des répulsions électrostatiques entre les vésicules, il empêchera donc l'agregation des liposomes.

Pour obtenir un volume interne important (celui de la phase aqueuse), il est souhaitable de déposer le film de lipides sur les parois d'un ballon de grande capacité (100mL- 250 mL) de sorte que le film soit étendu et très mince. Lors de la phase d'hydratation du film lipidique, la présence de quelques billes de verre de 0.5 à 3 mm de diamètre favorise l'opération.

Mise en oeuvre :

Film liposomes
envoyé par dlequoc

Les MLV constitués uniquement de lipides neutres ont des bicouches membranaires superposées qui sont proches les unes des autres. Ces liposomes ont donc très peu d'espace aqueux interne. La présence de lipides chargés négativement permet une répulsion des couches membranaires, ce qui augmente significativement le volume interne aqueux.

Préparation des "Small unilamellar vesicles" (SUV)

On peut préparer des SUV par sonication de MLV. Le générateur d'ultrasons peut être une sonde à ultrasons que l'on introduit dans le récipient qui contient les MLV ou un bain à ultrasons.

Photos

Mise en oeuvre de la préparation de SUV avec une sonde à ultrasons

On dépose un film de lipides secs (100 mg) dans un ballon en éliminant le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif de la même manière que celle utilisée pour la préparation des MLV.
On introduit ensuite 10 mL d'une solution aqueuse dans le ballon et on agite fortement pour décrocher le film de lipides.
On transvase la suspension lipidique dans un flacon en verre épais d'un diamètre légèrement supérieur à celui de la sonde à ultrasons.
On dispose le flacon dans un bain de glace et on introduit la sonde dans le flacon de sorte que son extrémité soit à 4 ou 5 mm en dessous de la surface du liquide.
On sonique par périodes successives de 15 secondes avec des interruptions de 30 secondes pendant 10 à 30 minutes.
Après la sonication laisser reposer pendant 2 heures à une température supérieure à la température de transition de phase des lipides.
On centrifuge la préparation à 100 000 g pendant 20 min pour sédimenter les MLV et les particules de titane de la sonde qui ont pu se décrocher.

Mise en oeuvre de la préparation de SUV dans un bain à ultrasons

On prépare des MLV à partir, par exemple, de 200 mg de phospholipides.
On transfère les MLV dans un erlenmeyer de 100 mL.
On fait passer un courant d'azote dans le flacon et on le bouche avec du parafilm.
On dépose l'erlenmeyer dans le bain à ultrasons. Le niveau de l'eau dans le bain à ultrasons doit être légèrement plus haut que le niveau du liquide dans la fiole.
On enclenche la sonication pendant 20-60 min en agitant la fiole de temps en temps.

Utilisation d'une presse de French

Les SUV peuvent également être préparés à parti de MLV en utilisant une presse de French .

L'extrusion des MLV sous forte pression (1500 à 2500 atmosphères) à 4°C conduit après un seul passage à des vésicules de 25 nm à 50 nm. Le diamètre des vésicules est toutefois supérieur à celui des vésicules obtenus par sonication.

Microfluidisation

Une suspension de MLV est envoyée à travers un filtre de porosité 5 µm sous forte pression (700 atm) dans une chambre d'interaction. A l'entrée de la chambre, les fluides sont séparés en deux canaux qui sont ensuite s'entrechoquer à l'autre extrémité avec des vitesses importantes (>500m/s) ce qui provoque la rupture des grosses vésicules et la formation de SUV. Après plusieurs passages, le diamètre des SUV est compris entre 100 et 200 nm.

Injection d'une solution éthanolique (ou solution étherée)

L'injection d'une solution éthanolique (ou étherée) de phospholipides dans une solution aqueuse conduit à la formation spontanée de liposomes. Le diamètre des vésicules dépend de divers paramétres : concentration des phospholipides dissouts, de la vitesse d'injection, de la vitesse d'agitation.
Les vésicules obtenues sont des SUV ou des LUV en fonction des conditions expérimentales.

Caractérisation des liposomes

Analyse chimique

Dosage

La quantification des phospholipides à partir de la masse n'est pas précise parce que les phospholipides peuvent contenir des quantités résiduelles de solvant non négligeables. Il est préférable de doser le phosphore par la méthode de Bartlett.

Chromatographie sur couche mince des phospholipides

Propriétés des vésicules intactes

Les liposomes sont utilisés comme réceptacles et vecteurs de composés actifs (médiacaments, produits cosmétiques ...). Il faut donc pouvoir quantifier non seulement la quantité de composé emprisonné dans le compartiment interne mais également la quantité ou la vitesse de relargage de ce dernier au cours du temps.

Détermination du pourcentage de capture : Centrifugation associée à une exclusion sur gel
Fry, DW.,White, C.and Goldman, D,J.(1978) Anal.Biochem.,90,809

Quand on utilise des liposomes pour piéger des substances actives, il est indispensable d'éliminer l'excès de substance qui n'a pas été encapsulée. A partir de là, on pourra estimer le pourcentage d'encapsulation et etudier ensuite le relargage du soluté en fonction du temps ou des conditions du milieu.

La filtration sur gel associée à la centrifugation est une méthode simple pour séparer les liposomes tout en éliminant les solutés de faible masse molaire non éncapsulés.

En utilisant comme gel du Sephadex G-50, on peut éliminer les solutés d'une masse molaire inférieure à 5000. La technique telle qu'elle est présentée à l'avantage de permettre une récupération des liposomes non dilués.

Détermination du pourcentage de libération : Utilisation d'un marqueur fluorescent, la calcéine ou la carboxyfluorescéine

On piège un marqueur coloré, radioactif ou fluorescent ou une enzyme dans les liposomes et on estime la quantité relarguée en fonction du temps ou des conditions du milieu.

La calcéine ou la carboxyfluoresceine sont deux marqueurs fluorescents qui ont la propriété d'émettre peu de fluorescence quand ils sont concentrés(self-quenching) et de fluorescer fortement en solution diluée.

L'intensité de fluorescence étant proportionnelle à la concentration du fluorophore, on peut déterminer la quantité de CF piégée à partir de la différence F1-Fo .

Détermination de la taille des liposomes

La microscopie électronique par coloration négative peut permettre de déterminer la taille des liposomes.
D'autres techniques physiques sont également utilisées :

La diffraction laser : La technique de la diffraction laser repose sur le fait que les particules passant devant un faisceau laser dispersent la lumière sur des angles qui sont inversement proportionnels à la taille des particules (les petites particules dispersent la lumière sur des grands angles et les grosses particules sur de petits angles). Il est alors possible de calculer une distribution de taille de particules si l'intensité diffusée a été enregistrée en fonction de l'angle.
La diffusion dynamique de lumière (DLS) : Cette technique mesure des fluctuations d'intensité en fonction du temps qui apparaissent lorsque les particules sont soumises au mouvement Brownien. L'analyse de ces fluctuations d'intensité permet la détermination d'une distribution de coefficient diffusion des particules. Elles sont converties en distribution de taille à l'aide de théorie établies.
La mesure du potentiel Zeta : Le potentiel Zeta représente la charge que la particule acquiert lorsqu'elle mise en suspension dans un liquide. Il dépend du pH, de la force ionique ou de la concentration d'un composant particulier. La mobilité des particules soumises à électrophorèse est mesurée par une technique appelée l'électrophorèse laser Doppler. Cette mobilité électrophorétique mesurée est convertie en potentiel Zeta grâce aux théories adéquates.

Stabilité des liposomes

Les liposomes sont susceptibles de subir diverses modifications au cours du temps.

Il peut y avoir des dégradations chimiques (oxydation ou hydrolyse) des phospholipides conduisant à la formation de lipides à courte chaine ou de lysophospholipides.
Les liposomes peuvent s'agréger, fusionner ou perdre leur contenu.

Un certain nombre de précausions peuvent limiter la dégradation chimique : utiliser des lipides fraichement purifiés, des solvants récemment distillés, travailler à basse température et sous atmosphère d'azote, conserver les liposomes sous une atmosphère inerte et en présence d'un antioxydant (alpha-tocophérol par exemple).

Exemples d'utilisation des liposomes

Les liposomes sont utilisés en pharmacologie pour tansporter des médicaments dans le corps des patients, en cosmétologie pour améliorer l'efficacité ou diminuer le carcatère irritant de produits de traitement de la peau et au laboratoire en biochimie des membranes pour étudier diverses propriétés de composants membranaires.

Il y a deux voies distinctes d'utilisation des liposomes : on peut encapsuler diverses molécules dans le liposome ou on peut greffer des molécules à la surface de la membrane du liposome.

Utilisations thérapeutiques

Les liposomes peuvent être utilisés pour véliculer des médicaments chez les malades avec un meilleur ciblage et une moindre toxicité par rapport au médicament non encapsulé. Il peut s'agir de médicaments anticancéreux, antimicrobiens, antiparasitaires ou antiviraux.

Selon la balance hydrophile/hydrophobe du médicament, le mode d'encapsulation sera différent : les médicaments hydrophiles (htdrosolubles) seront encapsulés dans le volume intraliposomal (à l'intérieur d'un liposome ou entre les couches membranaires s'il d'agit de MLV), à l'interface avec la membrane s'il s'agit de composés amphiphiles ou carrément dans la membrane s'il s'agit de composés lipophiles.

On peut envisager un ciblage des cellules à détruire par l'intermédiaire d'un immunoliposome. Celui-ci porte à sa surface une sorte de tête chercheuse constituée entre autres d'un anticorps spécifique qui est dirigé contre l'antigène de surface des cellules composant une tumeur. De ce fait le liposome ne viendra se fixer que sur les cellules qui possèdent cet antigène, d'où une spécificité d'action plus grande du produit.

Utilisations en cosmétologie

Les produits cosmétiques (antioxydants, collagène, etc.) sont en général appliqués localement sous forme d’émulsion huileuse ou de solution alcoolique. Or, l’huile et l’alcool peuvent endommager la peau en cas d’application prolongée. L’encapsulation dans des liposomes permet donc de contourner ce problème.

Dans certains cas, les liposomes peuvent fusionner avec les cellules de la peau et libérer leur principe actif directement dans la cellule.

Utilisations au laboratoire

Les liposomes sont utilisés pour étudier divers processus membranaires : mouvements flip-flop des lipides, propriétés des protéines membranaires après isolement, fusion des membranes...