Dosage du phosphore par la méthode de Bartlett

Le phosphore des molécules organiques est transformé en phosphate inorganique par chauffage intense en présence d'acide sulfurique. L'addition de molybdate d'ammonium complexe le phosphate inorganique en un complexe phosphomolybdique qui est réduit en un composé bleu par l'aminonaphtylsulfonate.

Les phospholipides contiennent 1 mol de phosphore par mole, excepté la cardiolipine (diphosphatidylglycerol) qui en contient 2.

Préparation des réactifs

Solution d'acide sulfurique 5M

• Prélever 140 mL d'acide sulfurique concentré et mélanger avec environ 300 mL d'eau distillée dans un bécher placé dans un bain de glace.
• Agiter avec une baguette de verre
• Transferrer la solution dans une éprouvette de 500 mL et compléter à 500 avec de l'eau distillée.
• Conserver la solution dans une bouteille en verre sous une hotte.

Solutions standard de phosphate

• Sécher un échantillon de dihydrogénophosphate de potassium à l'étuve à 105°C pendant 4 heures
• Peser 43.55 mg de dihydrogénophosphate de potassium sec et transferrer dans une fiole jaugée de 100 mL.
• Ajuster le volume à 100 mL avec de l'eau bidistillée.
• Cette solution de stock contient 3.2 µmol phosphore /mL

Les solutions standard seront préparées en diluant à 100 mL à l'aide de fioles jaugées 2.0 mL, 3.0 mL, 4.0 mL, 5.0 mL, 6.0 mL, 7.0 mL, 8.0 mL de la solution de stock.
Les concentrations de ces standard seront respectivement : 0.064, 0.096, 0.128, 0.160, 0.192, 0.224, et 0.256 µmol phosphore / mL

Solution sulfurique de molybdate d'ammonium

• Prélever 5 mL de la solution d'acide sulfurique 5M.
• Ajouter 50 mL d'eau distillée puis 0.44 g de molybdate d'ammonium
• Bien dissoudre le réactif et compléter la solution à 200 mL

Solution d'acide 1-amino 2-naphtyl 4-sulfonique

• Peser 0.8 g d'acide 1-amino 2-naphtyl 4-sulfonique (Réactif de Fiske et Subbarrrow)
• Dissoudre dans 5 mL d'eau bidistillée

Cette solution est à préparer le jour de son utilisation.

Solution de peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée) 10%

• Ajouter 1 mL d'eau oxygénée 100% à 9 mL d'eau

Cette solution doit être préparée juste avant l'utilisation.

Préparation des échantillons

Solution de phospholipides

Diluer la solution avec chloroforme/méthanol (2:1 v/v) de façon à avoir environ 1mg de phospholipide par mL.

Phospholipide solide

Préparer une solution à 1mg de phospholipide par mL avec chloroforme/méthanol (2:1 v/v).

Suspension de liposomes

Diluer la suspension avec de l'eau distillée pour avoir environ 1 mg de phospholipide/ mL.

Dosage

• Equilibrer une plaque chauffante ou un bain de sable à 200 °C pendant 30 min
• Déposer 0.5 mL de chaque solution standard de phosphore dans une série de tubes à essai
• Faire un blanc avec 0.5 mL d'eau distillée
• Préparer les tubes échantillons (3 exemplaires) en ajoutant 50 µL de solution essai dans chaque tube. Evaporer le solvant et remettre en solution dans 0.5 mL d'eau distillée.
• Ajouter 0.4 ml de la solution d'acide sulfurique 5M dans chaque tube et faire chauffer à 200°C pendant une heure.
• Laisser refroidir les tubes à température ambiante.
• Ajouter 0.1 mL de la solution de peroxyde d'hydrogène à 10% et chauffer à 200°C pendant 30 minutes pour obtenir une solution claire. Si nécessaire, répéter l'opération jusqu'à l'obtention d'une solution claire.
• Laisser refroidir les tubes à température ambiante.
• Ajouter 4.6 mL de la solution de molybdate d'ammonium dans chaque tube et agiter vigoureusement à l'aide d'un vortex.
• Ajouter 0.2 mL de la solution du réactif de Fiske et Subbarrow dans chaque tube et agiter vigoureusement à l'aide d'un vortex.
• Couvrir les tubes et les placer dans un bain-marie bouillant
• Laisser les tubes 7 min à partir de la reprise de l'ébullition.
• Laisser refroidir les tubes à température ambiante.
• Mesurer l'absorbance contre de l'eau distillée à 800 nm.

La méthode de Bartlett étant très sensible, il est indispensable de travailler proprement. En particulier, il faut utiliser des tubes de dosages lavés à l'acide (mélange sulfochromique) pour éviter la présence de traces de détergent.

Les milieux de suspension des liposomes ne doivent contenir d'ions phosphate.