Encapsulation d'une enzyme : la phosphatase alcaline

L'utilisation d'enzymes à des fins industrielles présente souvent des difficultés opératoires et impose des contraintes de coût. Séparer l'enzyme de la phase soluble principale où se produit la réaction peut présenter divers avantages : possibilité de récupération et de recyclage de l'enzyme, meilleure stabilité, contrôle du microenvironnement réactionnel ...

Une des possibilités pratiques pour réaliser ces conditions est d'encapsuler l'enzyme.

Le principe de l'encapsulation repose sur deux opérations successives:

La microencapsulation par séparation de phase (coacervation) ou par polymérisation interfaciale sont les 2 méthodes les mieux adaptées à l'encapsulation des enzymes. Cependant, les enzymes perdent souvent une partie de leur activité au cours du processus.

Il y a 2 raisons principales à cela :

Les avantages d'une encapsulation

Si les enzymes sont encapsulées dans de bonnes conditions :

Encapsulation par condensation interfaciale

Après réalisation d'une microémulsion, l'enzyme sera encapsulée dans une membrane semi-perméable par polycondensation interfaciale à température ambiante. La réaction de polycondensation met en jeu la création de liaisons amide entre un dichlorure d'acide (le chlorure de téréphtaloyle) et une diamine (1,6- hexanediamine). C'est la réaction de base de synthèse des nylons.

Quelques indications utiles sur les composés chimiques utilisés :

Réactifs à préparer pour réaliser l'encapsulation

Opération d'encapsulation :

L'émulsion est faite avec un agitateur magnétique (on utilise un bâton magnétique de 4 cm de longueur). Il faut que la longueur du barreau magnétique soit légèrement inférieure au diamètre du bécher utilisé pour la réaction.

Le processus est endothermique, la température du mélange s'abaisse spontanément.

Il faut ajouter la solution progressivement (2 gouttes /s) sous agitation continuelle pendant 3 minutes. Poursuivre l'agitation magnétique pendant 2 min. supplémentaires.

Attention : Avant de centrifuger, il faut prélever une petite fraction (environ 1 ml de la suspension) pour observer ultérieurement la préparation au microscope.

Les microcapsules sont ensuite remises en suspension dans 4 ml de Tween 20 à 50% tamponné par du Tris 0. 1 M, pH 9. On complète ensuite le volume à 15 ml de Tris 0, 1 M , pH 9

Attention:

Il faut réaliser l'addition de Tween très lentement , c'est l'opération la plus délicate du protocole.

L’observation au microscope permettra de vérifier que le transfert dans le Tween n’a pas provoqué la rupture des capsules.

Réactifs à préparer pour le dosage enzymatique :

Mesure de l’activité enzymatique après encapsulation

Faire 2 types essais :

Essai type 1 : 1.5 ml de tampon + 0.5 ml de pNPP + 100µl de microcapsules

Essai type 2 : 1.5 ml de tampon + 0.5 ml de pNPP + 5 µl d’enzyme libre à 1 mg /mL (sol de départ à 10 mg/mL diluée 10 fois)

Pour chaque type préparer 2 cuves:

Laisser la réaction sera donc opérante pendant 3 min à température ambiante (méthode en 2 points entre 2 min.et 5 min).

Pour arrêter la réaction ( à 2 min ou à 5 min) on ajoute 1 ml de NaOH 2 M. Agiter.

Centrifuger 5 min à 10 000 g avec une centrifugeuse de paillasse pour éliminer les capsules en suspension avant de faire la lecture en spectrophotométrie à 405 nm

Exploitation des résultats :

Fabrication des microcapsules  : observations et commentaires.

Encapsulation de la phosphatase alcaline  :

Opérations filmées (lien)