| Dosage enzymatique des substances |
Notions essentielles
Cinétique michaelienne :
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| Loi de vitesse : Vo = ( Vmax [So] ) / (Km + [So] ) Si on trace Vo en fonction de [So] on obtient une branche d'hyperbole Vo = vitesse initiale de la réaction pour une concentration initiale de So So = concentration initiale utilisée pour la réaction Vmax = vitesse initiale pour les concentrations ''saturantes'' de substrat. Km = constante de Michaelis |
Remarque : Km et Vmax sont des ''caractéristiques cinétiques'' de l'enzyme. La valeur de Vmax dépend de la température, du pH du milieu réactionnel, de la concentration en enzyme utilisée, c'est à dire des conditions expérimentales de l'étude.
| Figure 2 Pour déterminer la vitesse initiale d'une réaction, on trace la courbe qui donne la variation de la concentration du substrat ou du produit en fonction du temps c'est à dire [S] = f (t) ou [P] = f(t) |
| Figure 3 La vitesse initiale Vo est donnée par la valeur de la pente de la tangente à l'origine de la courbe. |
Pour déterminer les valeurs des caractéristiques cinétiques de l'enzyme (Km et Vmax), on a plusieurs possibilités :
a/- On trace la courbe Vo = f ( [So] ) (Fig 1)
La valeur de Vmax est donnée par la valeur de l'asymptote de la courbe hyperbolique,
La valeur de Km est l'abscisse du point de la courbe d'ordonnée Vo = Vmax /2.
Utiliser de préférence les méthodes suivantes pour la détermination de Km et Vmax car celle-ci est imprécise.
| b/- La méthode des inverses : on trace la droite 1/Vo = f ( 1/[So] ). L' équation est 1/Vo = (Km/Vmax) ( 1/[So] ) + (1/Vmax) La valeur de 1/Vmax est donnée par l'ordonnée à l'origine et la valeur de -1/ Km correspond au point de rencontre de l'abscisse et de la droite . |
Figure 4 |
| c/- On trace la droite Vo = f( Vo / [So] ). L'équation de la droite est Vo = - Km( Vo / [So] ) + Vmax La valeur de Vmax est donnée par l'ordonnée à l'origine. La valeur de Km est obtenue à partir de la valeur de la pente de la droite | Figure5 |
Les notions importantes à comprendre pour les applications
L'activité d'une enzyme est par définition la quantité de substrat transformé (ou de produit formé) par unité de temps et dans les conditions de fonctionnement optimales de l'enzyme (température, de pH …) . C'est une valeur de Vmax pour une quantité d'enzyme donnée .
La valeur de Vmax dépend de la quantité d'enzyme utilisée. La relation qui lie les 2 termes est : Vmax = kcat [Eo]
kcat = Vmax / [Eo] : kcat s'appelle l'activité molaire
L'activité molaire d'une enzyme est par définition l'activité par mole d'enzyme.
L'activité spécifique est l'activité exprimée par mg d'enzyme.
| L'activité molaire (ou spécifique) permet d'apprécier l'efficacité catalytique de l'enzyme dans les conditions optimales de fonctionnement de l'enzyme. L'unité de l'activité molaire est temps -1 . Pour déterminer la valeur de l'activité molaire, on trace donc la courbe Vmax = f ( [Eo] ) | Figure 6 |
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| Biochimie | Structurale | et | Analytiqueã | Danielle | et | Khanh | Lê-Quôc | 1999-2000 |