Techniques chromatographiques

1. Principes généraux

La chromatographie permet la séparation ou la purification d'un ou plusieurs composés d'un mélange pour permettre leur identification et leur quantification.

Le système permettant d'effectuer cette opération est appelé système de phases et comporte: la phase stationnaire et la phase mobile.
La phase mobile est, par définition, un fluide : liquide ou gaz . La phase stationnaire peut être un solide finement pulvérisé ou un liquide immobilisé sur une phase fixe, par exemple, un support poreux qui ne participe pas à la chromatographie.

Le processus de séparation de composés A et B dans un mélange
Résultat de l'opération de séparation : A et B sont séparés. B est récupéré avant A

La séparation des substances (A+B) dans le mélange tient au fait que le composé (A) est plus longtemps retenu sur la phase stationnaire de la colonne (ou sur la plaque) que le composé (B).

A la surface de la phase stationnaire, des forces d'attraction retiennent ou adsorbent pendant un court instant les deux composés. La rétention d'une substance dépend du choix de la phase stationnaire et de celui de la phase mobile (éluant).

Après un certain temps, les composés retournent de nouveau dans la phase mobile (qu'on appelle encore éluant) et sont transportés plus loin. Le processus recommence alors de nouveau.

On appelle rapport frontal (ou référence front) Rf la grandeur définie par :

A une température donnée, pour un système chromatographique défini (support, éluants), le Rf est caractéristique d'un soluté

Les différents types de chromatographie
On différencie plusieurs types d'échange mettant en jeu l'action de la phase stationnaire sur la molécule:

- la chromatographie d'adsorption
- la chromatographie de partage
- la chromatographie par échange d'ions
- la chromatographie d'affinité
- la chromatographie d'exclusion.

 

2. La chromatographie d'adsorption

En chromatographie d'adsorption, le composé est retenu par la phase stationnaire car il est adsorbé. La force d'interaction de la molécule avec la surface active de la phase stationnaire déterminera le temps de rétention. La silice est souvent utilisée comme phase stationnaire. C'est une phase hydrophile. Elle est caractérisée par des groupements hydroxyles qui se trouvent à la surface des particules. Ce sont ces groupes hydroxyles qui composent la surface de la phase stationnaire et qui, grâce aux forces d'attraction ou d'adsorption, vont retenir les différentes substances du mélange pendant une certain temps.   Le phénomène d'adsorption sera d'autant plus fort que la molécule sera polaire. En tant que phase mobile, on utilisera des solvants pas ou peu polaires.

3. La chromatographie de partage

Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un fluide qui, tel un film, a été déposé sur un support solide (par exemple sur un plaque recouverte de gel de silice ou de cellulose).
La phase stationnaoire liquide et la phase mobile ne doivent pas être miscibles.
La séparation des constituants du mélange est due à la différence de solubilité des substances entre la phase mobile et la phase stationnaire.

La façon dont une substance va se solubiliser entre les deux phases est donnée par le coefficient de partage. Si une substance se dissout bien dans la phase stationnaire, elle sera éluée plus tard qu'une substance se dissolvant mal dans la phase stationnaire mais bien dans la phase mobile.

Le coefficient de partage est donné par la relation :

indice 1 pour le solvant contenant initialement le soluté
indice 2 pour le solvant extractif

4. La chromatographie par échange d'ions ou appariement d'ions

En chromatographie par échange d'ions, on sépare les molécules chargées. La séparation est due aux différents équilibres électrostatiques entre la phase stationnaire - portant une charge inverse à celle du soluté - et le soluté . La phase stationnaire est une résine à la surface de laquelle sont gréffés des groupements ionisés. Un soluté se trouvera d'autant plus retenu que sa charge sera plus forte. Exemple de résine échangeuse d'ions: La résine est constituée par un polymère organique. Les groupements fonctionnels de la résine sont chargés positivement ou négativement selon qu'il s'agit d'une résine échangeuse d'anions ou d'une résine écahngeuse de cations. L'ion échangeable est appelé contre-ion. Résines cationiques fortes: Res-SO3- H+ Res -SO3- Na+ Résine sous forme acide Résine sous forme sodique Résines anioniques fortes : Res - CH2 - N (CH3)3+ avec Cl- ou OH- comme contre-ions

5. La chromatographie liquide à haute pression

La séparation des constituants du mélange se fait sous pression.
Dans la technique de chromatographie liquide à haute pression (CLHP), on peut rencontrer les différents processus de séparation décrits ci-dessus : la chromatographie d'adsorption ( liquid- solid -chromatography , LSC), la chromatographie de partage ( liquid-liquid-chromatography , LLC) , la chromatographie par échange d'ions (ion-exchange-chromatography , IEC) et la chromatographie d'affinité (affinity-chromatography , AFC)

Deux cas de figure courants :
1. CLHP d'adsorption en phase normale :
La phase stationnaire est de la silice ou un dérivé organo-silicique. Il s'agit d'une phase polaire .
L'éluant est un solvant organique de polarité variable : phénol (très polaire) à hexane (apolaire) .
La séparation sera telle que les composés polaires seront plus retenus que les composés apolaires.

2. CHLP d'adsorption en phase inverse (reversed phase)
Les phases stationnaires et mobiles sont de polarité inverse au cas précèdent. La phase stationnaire est apolaire et la phase mobile est polaire. La phase stationnaire est une silice sur laquelle sont gréffées des chaînes carbonées hydrophobes. La phase mobile est souvent un mélange méthanol/ eau ou acetonitrile / eau. Le pourcentage d'eau dans l'éluant est déterminant pour la séparation.

6. La chromatographie d'affinité

Dans la chromatographie d'affinité, un des composants du mélange se fixe spécifiquement sur le gel de la colonne qui a été préparé à cet effet. La spécificité repose sur une fixation du type : antigène-anticorps ou enzyme-inhibiteur. Lorsque l'échantillon est déposé sur la colonne, seul le composé ayant de l'affinité pour le ligand fixé sur la colonne sera retenu. La désorption est obtenue par modification contrôlée du pH et /ou de la concentration saline de l'éluant.

Techniques d' électrophorèse

1. Principe général

Le déplacement de particules chargées, dans un solvant, sous l'action d'un champ électrique, est appelé électrophorèse.
Un grand nombre de composés biologiques (protéines, acides nucléiques ) possèdent des charges électriques intrinsèques et, de ce fait, sont capables de se déplacer dans un champ électrique. Cette propriété permet de caractériser ou de séparer certains types de composés suivant leur charge, leur forme et leur poids moléculaire.

La théorie de l'électrophorèse est très complexe et n'est pas à l'heure actuelle suffisamment complète pour permettre d'expliquer tous les phénomènes. Cependant, une description schématique du principe suffit pour comprendre la technique.
Une particule de charge q placée dans un milieu soumis à un champ électrique E, se déplacera à une vitesse constante V si aucune force ne s'applique sur elle, c'est à dire si la force électrique (q x E) et la force de frottement (f x V) sont égales ( f est le coefficient de frottement).
La mobilité u de cette particule est, par définition, égale à la vitesse V par unité de champ :
u = V / E = q / f
La mobilité est donc reliée au coefficient de frottement, qui lui-même dépend des caractéristiques physico-chimiques de la particule (grandeur, forme, densité etc...).

2. Electrophorèse des petites molécules chargées

Les composés chimiques se déplaceront plus ou moins selon leur charge à un pH donné et pourront donc être séparés sur un support.
On sépare ainsi les acides aminés ayant des points isoioniques différents en provoquant leur migration sur une feuille de cellulose, humectée par un tampon à un pH défini, en appliquant un champ électrique de quelques dizaines de volts par cm.

3. Electrophorèse des macromolécules sur gel

L'électrophorèse peut être faite en milieu semi-solide (gel). Le gel est constitué par un polyacrylamide réticulé (pour les protéines) ou un gel d'agarose (pour les polynucléotides).

Application aux protéines
La technique d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide permet non seulement de séparer les protéines les unes des autres mais également de déterminer leur masse molaire.
Lorsque les protéines sont traitées par un détergent ionique : le dodécylsulfate de sodium (SDS), en présence de mercaptoéthanol, thiol qui réduit les ponts disulfure, il se produit une dénaturation de la structure. Au cours de ce processus, les structures secondaire, tertiaire, quaternaire si il y en a, sont perdues.

Les complexes formés par les protéines traitées au SDS ont une structure semblable, indépendante de la forme de la protéine native et un rapport charge/masse identique d'une protéine à l'autre. Toutes les protéines fixent la même quantité de SDS (1,4 g / g de protéines). La charge du complexe est alors , en fait, déterminée par le SDS fixé plutôt que par la charge intrinsèque des résidus amino-acides.
Dans ces conditions, la mobilité électrophorétique est directement liée à la masse molaire de la protéines.

log PM = f (distance de migration) est une droite

On peut, après étalonnage d'un gel à l'aide de protéines de PM connus, déterminer la masse molaire d'une protéine inconnue.

Tamisage moléculaire

1. La filtration sur gel

Le gel introduit dans la colonne se comporte comme un tamis moléculaire qui sépare les molécules de taille et de masse molaire différentes. La matrice de gel est composée de billes de polymère poreuses en suspension dans un éluant.
Si un mélange de macromolécules est déposé au sommet de la colonne, les grosses molécules ne pourront pas pénétrer dans les pores des billes et s'écouleront autour dans le liquide interstitiel. Elles sernt ainsi éluées en premier. Les molécules plus petites qui pénètrent à l'intérieur des pores sont retardées. Elles seront éluées après les grosses molécules dans l'ordre décroissant des tailles et des masses molaires.

Il est également possible de standardiser la colonne avec des macromolécules de masses molaires connues afin de déterminer la masse molaire d'une protéine inconnue. Les volumes d'élution sont représentatifs de la grosseur de la molécule.
Il existe une relation simple entre le volume d'élution de la macromolécule (Ve), le volume mort (Vo) et le volume total de la colonne (Vt) :
K = [Ve-Vo] / [Vt -Vo] = - a log MM + b

La constante K est établie pour chaque colonne dans les conditions d'expérience.
Vt est la valeur du volume d'élution d'une substance de masse molaire faible, inférieure à la limite inférieure de séparation du gel. Vo est le volume mort de la colonne. Il est déterminé à partir de l'élution d'une très grosse macromolécule, de masse molaire supérieure à la limite supérieure de séparation de la colonne. En général, on utilise le bleu dextran de masse molaire 2 millions pour déterminer Vo.
Les coefficients a et b de la droite sont déterminés à partir de résultats obtenus pour des macromolécules de masse molaire connue.

2. L'ultrafiltration

Il s'agit de la séparation sous pression de substances au travers d'une membrane perméable aux petites molécules. La porosité de la membrane utilisée détermine les possibilités d'application de la technique. Cette méthode permet donc de concentrer les macromolécules les plus grosses contenues dans une solution.