TECHNIQUES DE DOSAGE PAR SPECTROPHOTOMETRIE UV ET VISIBLE

Exercices: 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9


Exercice 1: Coefficient molaire d'absorption

Calculer le coefficient d'extinction molaire de la cobalamine à 351 nm. Longueur du trajet optique : 1 cm

Solution C (M) Io I
A 2,23.10-5 93,1 27,4
B 1,90.10-5 94,2 32,8

 


Exercice 2: Unités des coefficients molaires d'absorption

Une solution de NADH ne transmet que 23 % de la lumière à 340 nm. Sachant que le coefficient d'absorption du NADH est égal à 6,22 106 cm 2 mol-1 à 340 nm, que le trajet optique est égal à 1 cm, calculer la concentration du NADH dans la solution.


Exercice 3: Notions de DO et de transmission

Une solution contenant de l'ATP 10-5 M donne 70,2 % de transmission à 260 nm dans une cuve de 1 cm.
Calculer :
1. la transmission de la solution dans une cuve de 0,5 cm
2. la DO dans des cuves de 1 cm et 0,5 cm
3. la DO et le % de transmission d'une solution d'ATP 2.10-5 M dans une cuve de 1 cm.


Exercice 4: Notions de DO et de transmission

Le coefficient d'absorption molaire du NADH à 340 nm est égal à 6,22 103 M-1cm-1.
Un volume de 5 ml d'une solution contenant 0,4 micromole de NADH est introduit dans une cuve colorimétrique de 1,05 cm de côté.
Calculer la DO et le % de transmission de cette solution à 340 nm.


Exercice 5: Additivité des DO

L'absorbance d'un échantillon enzyme + AMP est égale à 1,45 à 280 nm et 0,78 à 260 nm.
Calculez la concentration de chacun des composés sachant que :

  Coeff. d'absorption molaire (cm2.mol-1)
Composé 260 nm 280 nm
Enzyme 1,52 107 2,96 107
AMP 1,50 107 2,40 107

 


Exercice 6: Détermination graphique des concentrations

On a effectué le dosage spectrophotométrique du NADPH à 340 nm. Les résultats sont les suivants :

Tubes B 1 2 3 4 5 E1 E2
NADPH x 105 M 0 1 2 3 4 5 X1 X2
DO 0 0,06 0,12 0,18 0,24 0,30 0,15 0,16

Déterminer graphiquement la concentration du NADPH dans la solution inconnue.


Exercice 7: Dosage à partir d'une gamme étalon

Le tableau suivant représente les résultats de mesure d'un dosage de protéines par la méthode du biuret.

  B 1 2 3 4 5 E1 E2
Solution de BSA (5 mg/ml)
Volume en ml
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 0
Echantillon à doser
en ml
- - - - - - 0,2 0,2
Solution NaOH 10 %
Volume en ml
2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2,0 ? ?
Solution CuSO4 1 % 0,3 ml
Mesure à 540 nm
Valeur de la DO
0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,135 0,140

Déterminer graphiquement la quantité de protéines de l'échantillon à doser.


Exercice 8: Dosage enzymatique des constituants d'un mélange

Une solution contient un mélange d'acide fumarique et d'acide malique à pH 7,0.
A 1 ml de cette solution, on ajoute 1 ml d'une solution tampon contenant un excès de NAD+ et l'enzyme malate déshydrogénase. Le mélange est introduit dans une cuve de spectrophotomètre de 1 cm de trajet optique. La densité optique de la solution à 340 nm passe de 0 à 0,32. On introduit ensuite dans la cuve 1 ml d'une solution tampon contenant l'enzyme fumarase. La densité optique de la solution augmente et se stabilise à 0,85.

1. Expliquez les augmentations de DO
2. Calculez la concentration de l'acide fumarique et de l'acide malique dans la solution initiale.

Le coefficient molaire du NADH est égal à 6,22 103 M-1.cm-1.
Fumarate + H20 ---> Malate (catalysée par la fumarase)
Malate + NAD+ ---> Oxaloacetate + NADH + H+ (catalysée par la malate déshydrogénèse)


Exercice 9: Analyse cinétique d'une réaction enzymatique

La phosphatase alcaline catalyse la réaction suivante :

Para-nitrophénylphosphate + eau <---> para-nitrophénol + phosphate

Le para-nitrophénylphosphate (pNPP)est incolore alors que le para-nitrophénol est jaune (il absorbe à 405nm).

On se propose d'étudier la cinétique de la réaction en opérant de la manière suivante : on met dans cuve colorimétrique (1cm de trajet optique) 1,5mL d'une solution pH = 8,8 et on ajoute 0,4 mL de pNPP 5mM et 0,1mL d'enzyme (1mg/mL) . On mesure l'absorbance à 405 nm en fonction du temps. Calculer la vitesse initiale de la réaction exprimer en DO par minute et en mole par minute, sachant que les résultats de mesure sont reportés dans le tableau suivant :

Temps (s) 10 20 30 40 50 60
Absorbance 0,1 0,2 0,3 0,35 0,38 0,4

NB : le coefficient molaire du pNP est égal à 14500 M-1 cm-1

Biochimie Structurale et Analytiqueã Danielle et Khanh Lê-Quôc 1999-2000