SPECTROPHOTOMETRIE

1. L'absorption de la lumière

Figure des transitions électroniques

L'absorption d'un photon est en général le fait d'un petit groupe d'atomes dans une molécule (par exemple, un noyau benzénique dans une molécule d'acide aminé entraîne l'apparition d'un pic d'absorption en U.V. au voisinage de 280 nm). Les groupes d'atomes possédant ces propriétés optiques sont appelés chromophores. Une molécule qui absorbe la lumière possèdera un spectre d'absorption qui sera caractéristique du composé chimique et qui ne dépendra que de la concentration du composé.

2. Mesure de la quantité de lumière absorbée

2.1. Appareillage

L'appareil utilisé est un spectrophotomètre. Le spectrophotomètre permet de mesurer la quantité de lumière absorbée ou émise par une substance, en fonction de la longueur d'onde.

On distingue, en fonction du rayonnement étudié, plusieurs de spectrophotomètres : les spectrophotomètres d'absorption U.V. -Visible , les spectrophotomètres de mesure de fluorescence (fluorimètres), les spectrophotomètres de mesure de phosphorescence etc…
La figure suivante représente le schéma d'un spectrophotomètre d'absorption U.V - Visible .

On distingue 4 parties essentielles :

- une source de lumière polychromatique (lampe au tungstène ou au deutérium)
- un monochromateur (sélection des longueurs d'onde)
- un photomultiplicateur qui transforme la lumière en courant électrique et qui en même temps amplifie le signal
- un amplificateur qui augmente l'intensité du signal électrique
- un convertisseur qui transforme le signal électrique en données numériques ou analogiques.

L'enregistrement graphique de la quantité de lumière absorbée par une substance en fonction de la longueur d'onde est appelé spectre d'absorption de la substance.

Chaque substance possède un spectre d'absorption qui lui est propre (voir figure ci-contre). La quantité de lumière absorbée pour une concentration donnée de la substance varie en fonction de la longueur d'onde. La longueur d'onde pour laquelle l'absorption est maximale est notée l max (lambda max).
Une substance qui peut absorber ou émettre de la lumière s'appelle un chromophore.

2.2. Aspect quantitatif

La fraction de la lumière incidente qui est absorbée par une substance dépend du trajet optique (l) , de l'intensité du rayonnement incident (I_o), de la concentration C de la substance en solution. La relation qui lie ces différentes grandeurs est la loi de BEER-LAMBERT:

log ( I_o/I) = log (1/T) = e C L = A = D.O = E

log( I_o/I) est appelé absorbance (A) , densité optique (D.O) ou extinction (E)
T = log (I_o/I) est la transmission
e est le coefficient molaire d'absorption

Si l est égale à 1 cm et C à 1 mol/L, alors l'absorbace est égale à e .

e est une grandeur caractéristique du composé.
Dans le cas où les masses molaires ne sont pas connues (cas de nombreuses protéines, acides nucléiques) , on utilise le coefficient d'absorption spécifique. Ce coefficient est l'absorbance d'une solution à 10 g/L (1% p/v) d'un composé pour un trajet optique de 1 cm et s'écrit sous la forme :

C est la concentration molaire du soluté
l est le trajet optique exprimé en cm.

Dans le cas où les solutions contiennent plusieurs chromophores, la densité optique de la solution est égale à la somme des densités optiques attribuables à chaque composant du mélange.