Le dosage colorimétrique
La technique repose sur la loi de BEER-LAMBERT qui exprime la proportionalité entre l'absorbance de la lumière à une longueur d'onde donnée et la concentration de la substance qui absorbe.

Le choix de la longueur d'onde de mesure est vaste puisque la loi de Beer-Lambert s' applique à toute longueur d'onde. Cependant, pour avoir une bonne sensibilité de dosage, on choisit de préférence une longueur égale à un l max ou proche d'un l max du composé coloré.

Le principe de la technique est le suivant : on réalise une gamme étalon constituée d'une série de solutions de concentrations connues du composé à doser et on mesure l'absorbance de chaque solution. On reporte les résultats de mesure sur un graphe avec en abscisses la concentration (ou la quantité) de substance et en ordonées la valeur d'absorbance correspondante. Ce graphe constitue la droite étalon ou droite d'étalonnage.



On réalise une gamme étalon


On mesure les valeurs d'absorbance de chaque cuve.
On établit la droite d'étalonnage pour exploiter les résultats de mesure.
Cas le plus simple : dosage d' une substance colorée Par exemple : dosage d'une solution de bleu de bromophénol La gamme étalon est faite avec une solution de bleu de bromophénol de concentration connue. L'absorbance de la solution à doser est mesurée. La concentration correspondante est déterminée avec la droite d'étalonnage.

Cas plus compliqué : dosage d'un composé incolore
Par exemple : dosage d'une solution de protéines

On effectue, préalablement au dosage, une réaction de coloration de la substance à doser. Dans l'exemple présenté, les protéines sont traitées par un sel cuivrique en milieu alcalin ce qui provoque une coloration des protéines en bleu.

 

 Protocole expérimental de la technique de dosage: dosage du biuret

Les limites de la technique :

  • La loi de Beer-Lambert n'est pas valable sur toute l'échelle des concentrations. En général, la linéarité n'est plus respectée avec des solutions concentrées. Il faut donc s'assurer que les concentrations de la gamme étalon donnent bien une réponse linéaire et il faut que l'échantillon à doser soit compris dans l'intervalle des concentrations de la gamme étalon.

  • Il faut impérativement que les solutions à doser soient parfaitement limpides.